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​DNA提取（一）

点击次数：  更新时间：2018/5/21 14:43:54  

DNA提取

（一）培养细胞DNA提取

1、原理

    细胞裂解液中含有去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），溶解细胞膜、核膜，破坏细胞并释放出来DNA。蛋白酶K是光谱蛋白酶，能在SDS和EDTA存在下保持高活性。SDS破坏细胞，并将组氨酸从组蛋白分子中拆下，而EDTA能抑制DNase的活性，蛋白酶K将所有蛋白降解成为肽或小片段氨基酸，遂使DNA分子能完整的被分离出来，再用RNase去掉RNA、通过酚/氯仿反复抽提获得纯净DNA。

2、试剂

PBS缓冲液、细胞裂解液、蛋白酶K溶液、tris饱和酚、氯仿、TE缓冲液、RNaseA 、3M醋酸钠（PH 7.4）、乙醇等。

3、破碎细胞、释放核酸（一）

（1）取对数生长期细胞，1×10⁶~10⁹个细胞。

（2）弃上清液，PBS液冲洗2次。

（3）加入约250ul细胞裂解液，缓慢混匀。

（4）37℃孵育20min。

（5）加入适量蛋白酶K（终浓度达到100ug/ml），混匀。

（6）55℃，水浴1H。

（7）加入150ulTris饱和酚（PH8.0），混匀。

（8）加入等体积（150ul）氯仿，轻柔混匀1min。

（9）12000rpm，室温，离心10min。

（10）上清液移至一个新的1.5ml离心管中。

（11）重复（7）~（10）2~3次，直至离心后液面间没有蛋白。

（12）加入250ul氯仿，轻柔混匀1min，弃上清液。

（13）12000rpm，室温，离心10min，弃上清液。

（14）加入0.1×体积3mol/L NaAc（pH 5.2）,混匀。

（15）加入2.2×体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀。

（16）-20℃，放置30min或过夜。

（17）12000rpm，室温，离心10min。

（18）弃上清液，加入1ml预冷的70%乙醇洗涤2min。

（19）12000rpm，室温，离心10min。

（20）弃上清液，将残留尽量吸干。

（21）室温，晾晒。

（22）用适量TE或去离子水溶解DNA。定量、标记后-20℃保存。