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体外DNA重组技术--RNA的制备

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:42:30  

RNA的制备

【实验目的】

1． 理解生物细胞中RNA制备方法的原理。

2． 熟悉组织细胞中RNA制备的基本操作。

（一）细胞总RNA的提取

1. 异硫氰酸胍法

【实验原理】

异硫氰酸胍法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法，其基本原理是：异硫氰酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性，通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞

【实验试剂与器材】

（1）GuSCN缓冲液：

4 M异硫氰酸胍(GuSCN) ，25mmol/L 柠檬酸(pH7.0)，0.5% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）。配制方法：先称取GuSCN加少量双蒸水溶解，然后加入其余成分，65℃加热使其充分溶解，4℃保存备用。

（2）GuSCN/25mmol/L β-巯基乙醇溶液：

将0.36ml β-巯基乙醇溶于200ml GuSCN缓冲中，4℃保存备用。

（3）2M NaAc (pH 4.0)

（4）0.1% DEPC-H2O：将0.1 ml DEPC加入100ml双蒸水中，室温摇晃12~24小时，然后15磅高压15min（注意：若用此水处理容器，可以不用高压处理）

（5）氯仿:异戊醇 (49:1, v/v)

（6）DEPC-H2O饱和酚：

将DEPC-H2O和酚1:1混合，室温摇晃1小时，然后静止使其分层，吸除水相，再加入DEPC-H2O重复一次，此即DEPC-H2O饱和酚。

（7） 无水乙醇

（8） 75%冰冷乙醇

【实验方法与步骤】

（1）取离心洗涤后的1×106培养细胞或相当量的研磨后的组织，加入200?滋l GuSCN/25mM）-巯基乙醇溶液，剧烈震荡使细胞裂解，此时溶液变黏稠；

（2）加入下列成分：2M NaAc (pH4.0) 25?滋l，DEPC-H2O饱和酚240?滋l，氯仿:异戊醇    (49:1,v/v) 50?滋l，剧烈震荡10秒钟，冰浴15min；

（3）4℃，10,000×g离心30min，使其充分分层，水相应透明无任何混浊 [注：RNA在上    层水相，DNA和蛋白质在中间相和酚相中]；

（4）将上层水相转移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（5）弃上清，加入100?滋l GuSCN缓冲液将RNA沉淀溶解，然后加入200?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（6）弃上清，用75?滋l DEPC-H2O溶解RNA沉淀，加入7.5?滋l 2M NaAc (pH4.0)，165?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；

（7）弃上清，加入75%乙醇(-20℃)1ml，不要混合，4℃，7500×g离心10min；

（8）弃上清，室温自然干燥RNA沉淀 (注意：RNA沉淀不能过分干燥，否则将无法使其溶解)；

（9） 用DEPC-H2O溶解RNA备用。若长期保存，应将RNA悬于75%乙醇中置-20℃。

【注意事项】

1. 所有试剂均用DEPC-H2O配制；操作中要防止RNA酶的污染，必须戴手套，戴口罩，玻璃器皿可在烤箱中180℃烘烤2h，灭活RNA酶，或者用新的。

2. Trizol试剂法：原理、试剂、器材.

用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)在室温下可提取RNA、DNA及蛋白质，具有快速方便、提取量大等优点。

【实验方法与步骤】

（1）0.5~1×107 细胞或相当量的组织，用1ml Trizol试剂裂解细胞，摇动混合后室温孵育5~10min；

（2）加入2氯仿，震荡混匀15秒，置室温2～3min；

（3）10,000×g，4℃离心15min，将水相移至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，混合后室温沉淀10min，10000×g离心10min；

（4）弃上清，加入1ml 75%乙醇，不混合，7500×g离心10min；

（5）弃上清，室温下空气蒸发残存的乙醇。

3. Oligo(dT)纤维素层析法提取mRNA

【实验原理】

真核细胞的3’端有poly(A)尾，因此可用Oligo(dT)纤维素结合mRNA，从而将mRNA从总RNA中分离出来。Oligo(dT)纤维素就是将Oligo(dT)15～18结合到纤维素上，制备成能特异性结合带Poly(A)尾RNA的纤维素。

【实验试剂与器材】

（1）Oligo(dT)纤维素

（2）层析柱装置

（3）1×上样缓冲液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS)

配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分确切含量后，15磅高压15分钟，待溶液冷却至65℃时，加入预先在65℃水浴30min的10% SLS，至终浓度为0.1%。也可用0.05M柠檬酸钠代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC处理整个缓冲液。

（4）洗脱缓冲液:  10 mM Tris.HCl (pH7.6)，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.05% SDS

先将Tris.HCl和EDTA混合后高压，然后加10%SDS至所需浓度，此缓冲液配制后不可高压。

（5）3M NaAc (pH5.2)

（6）DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)处理水：0.1% DEPC双蒸水，37℃摇动温育至少12h，然后15磅高压15min。

【实验方法与步骤】

（1）将0.5～1g的Oligo(dT)纤维素悬于0.1M NaCl溶液中，然后用0.5~1ml装柱；用3倍柱容积的DEPC-H2O洗柱，再用1×上样缓冲液洗柱，至洗出液pH<8.0；

（2）将RNA溶液在65℃加热5min，然后迅速冷却至室温，加入等体积的2×上样缓冲液，混合后直接上样，并收集流出液。重复此过程2-3次以使mRNA更充分地结合到纤维素上；

（3）用2～3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱mRNA；

（4）加入1/10容积的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脱液中，混合后加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后-20℃沉淀30min；

（5）10000×g，4℃离心15min，弃上清。用70%乙醇漂洗，10000×g离心5min，弃上清,室温蒸发乙醇；

（6）用适量的无RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于Northern印迹，RT-PCR及核酸保护试验。若长期保存，可加入3倍体积的无水乙醇，置-70℃。

【注意事项】

（1）因为RNA易被RNase降解；整个操作不能有RNase的污染，同时要注意无菌操作。

（2）所有试剂的配制均用DEPC处理过的水

（3）加入3倍体积的100%乙醇于RNA溶液中，-70℃可长期保存.

（4）此RNA可用于第一股cDNA的合成，Northern印迹，核酸酶保护试验等。