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体外DNA重组技术--基因组DNA的制备

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:36:10  

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。

DNA重组技术的基本程序包括：

（1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。

（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。

（3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。

（4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。

（5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。

下面以质粒为例DNA体外重组的基本程序：

一、基因组DNA的制备

【实验目的】

1． 理解生物细胞基因组DNA制备方法的原理。

2． 熟悉组织细胞基因组DNA制备的基本操作。

【实验原理】

在阴离子去污剂（SDS-十二烷基硫酸钠）以及酚/氯仿/异戊醇作用下可以使细胞膜破坏，核蛋白质变性，将染色体DNA分离出来。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞。

（一）从哺乳动物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. 消化缓冲液：100mM NaCl，10mM Tris.Cl (pH8.0)

                25mM EDTA (pH8.0)，0.5% (w/v) SDS，0.1mg/ml蛋白酶K。

2. 7.5mol/L乙酸铵。

3. 100%乙醇。

4. 酚/氯仿/异戊醇。

【实验方法与步骤】

1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存；

2. 将200mg～1g的组织用预冷的研钵研碎，或用锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2ml消化缓冲液悬浮，然后于50℃摇荡温育12~18h；

3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700×g，离心10min。如果样品溶解得不好，再加1体积不含蛋白酶K的消化缓冲液，重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质，重复抽提一次，将上层(水溶液)转移至一个新离心管中；

4. 加入1/2体积7.5mol/L乙酸铵和2倍体积100%乙醇，12 000rpm离心2min；

5. 用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液或无菌双蒸水重新溶解,使终浓度在约1mg/ml。注: 加入0.1%的SDS和1?滋g/ml无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h，以除去残留的RNA。

    

6. 重复步骤4、5。1g细胞大约能提取到2mg DNA。

（二）从植物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. CTAB抽提液：2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，100mM Tris.Cl，pH8.0，                20mM EDTA，pH8.0，1.4M NaCl

2. CTAB/NaCl溶液：10% CTAB，0.7M NaCl

配制方法：在80ml双蒸水中溶解4.1g NaCl，然后缓慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，同时加热并搅拌，可加热至65℃溶解，定容终体积至100ml。

3. CTAB沉淀液：  1% (w/v) CTAB，50mM Tris.Cl (pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)

4. 高盐TE缓冲液:  10mM Tris.Cl (pH8.0)，0.1mM EDTA (pH8.0)，1M NaCl

 

【实验方法与步骤】

1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇，使终浓度达2% (v/v)。将此溶液及    CTAB/NaCl溶液加热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-巯基乙醇/CTAB抽提液和0.4~0.5ml的CTAB/NaCl溶液；

2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷冻匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中；

3. 往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育10~60min，期间不时混匀；

4. 用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，上下颠倒充分混合，7500×g，4℃，离心5min，回收上层水相；

5. 加入1/10倍体积的65℃预热CTAB/NaCl溶液，上下颠倒混匀；

6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上层水相；

7. 加入1倍体积的CTAB沉淀液，上下颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤8，也可于65℃温育30min；

8. 500×g，4℃，(或约2700rpm)离心5min；

9. 移出上清，用高盐TE缓冲液重悬沉淀(按每克起始材料加0.5～1ml)，如果沉淀很难溶解，于65℃温育直至所有的或大部分沉淀溶解；

10. 加入0.6倍体积异丙醇沉淀核酸，充分混匀，7500×g，4℃，离心15min；

11. 用75%乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的TE或水重悬(每克起始材料0.1～0.5ml)。

【注意事项】

基因组DNA分子量大，所有操作必须轻柔，酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用，应该戴手套操作。