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体外DNA重组技术--​质粒DNA的制备

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:47:38  

质粒DNA的制备

【实验目的】

熟悉质粒DNA常用的制备方法

【实验原理】

 转化细胞中的质粒DNA制备主要包括三个步骤：细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁，从而使质粒释放出来。

【实验试剂与器材】

1. 细胞悬浮液:  50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl,（ pH8.0），10mM EDTA.Na2,（pH8.0）

2. 细菌裂解液:  0.2mol/L NaOH，1% SDS

3. 中和液:  60ml 5M醋酸钾，11.5ml 冰醋酸，28.5ml双蒸水

4. 3mol/L NaAc  (pH 5.2)

5. TE饱和酚 (pH8.0)

6. 氯仿/异戊醇 = 24:1

7. RNase（20mg/ml）

【实验方法与步骤】

（一）质粒的小量制备:

1. 将5ml LB培养液(含筛选抗生素)加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中，37℃以225rpm速度振荡培养14-16h；

2. 10,000rpm，4℃离心5min，弃培养液；

3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来，室温放置5min；

4. 加入细菌裂解液，上下颠倒微量离心管以裂解细菌，待溶液变黏稠为止；

5. 加入中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000rpm，4℃离心5min；

6. 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和酚/ 氯仿(1:1)混合液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

7. 将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

8. 将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀15-30min，然后12,000 rpm离心15min；

9. 弃上清，于沉淀中加入100?滋L双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀，加入20?滋g/ml RNase，置室温30min，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min，将上层水相移至另一离心管中，加入0.1倍体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置-20℃沉淀15~30min，然后离心15min；

10. 弃上清，加入70%乙醇( 注意不要混合)，12000rpm离心10min；

11. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；

12. 用去离子水溶解质粒DNA，-20℃保存备用。

（二）质粒的大量制备:

1. 将5ml转化菌种接种于500ml LB培养液(含用于筛选的抗生素)中，37℃以225rpm速度振荡培养12～16小时；

 

2. 10,000rpm，4℃离心15min收集菌体；

3.将细菌悬浮于100ml预冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm离心收集菌体；

4. 将菌体悬于10ml细菌悬浮液中，再移至50ml离心管中；

5. 加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鲜配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，混合后室温孵育30min；

6. 加入15ml新鲜配制的细胞裂解液，上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止；

7. 加入10ml预冷的中和液，上下颠倒混匀，冰浴10min；

8. 12,000rpm，4℃离心20min；

9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10min，12,000rpm，室温离心5min；

10. 弃上清，于沉淀中加入水和RNase，置室温30min，然后用氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，于上层水相中加入0.1倍体积3M NaAC（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，-20℃ 沉淀15min，12,000rpm离心15min；

11. 弃上清，用75%乙醇室温洗一次，12,000rpm，离心10min；

12. 弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；

13. 加适量去离子水或TE缓冲液(pH8.0)溶解质粒DNA，-20℃保存备用。