实验服务

微生物学 您的位置:首页 > 实验服务 微生物学

病毒培养实验——组织培养法--原代细胞单层培养

点击次数:  更新时间:2017/4/29 15:00:43  

   关于病毒培养实验,由于病毒必须在易感的活细胞内才能增殖,因此,根据不同病毒选择敏感动物,离体组织细胞和鸡胚进行分离培养。


   实验方法原理:


   组织培养是目前培养病毒应用最广的一种培养方法,它的优点是:


   经济适用,结果正确且敏感


   较实验动物易于控制


   原代细胞单层培养法,是指动物(包括脊椎动物和无脊椎动物)的组织自机体取出后,经胰酶或其他细胞分散剂消化处理,得到单个细胞悬液。以一定量接种到特定容器中,加入细胞生长所必需的营养液,置合适温度中经一段时间的培养,分散的单个细胞即贴附玻壁,开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。


   实验步骤:


   1.  原代细胞单层培养


   原代细胞单层培养法,是指动物(包括脊椎动物和无脊椎动物)的组织自机体取出后,经胰酶或其他细胞分散剂消化处理,得到单个细胞悬液。以一定量接种到特定容器中,加入细胞生长所必需的营养液,置合适温度中经一段时间的培养,分散的单个细胞即贴附玻壁,开始分裂增殖并逐步长成均匀致密的单层细胞。


   (1)取鸡胚:用碘酒棉球消毒气室端卵壳,再以酒精棉球消毒,然后以无菌镊子打开气室端卵壳,除去壳膜,换一把小镊子取出鸡胚胎,置于平皿中。


   (2)剪碎,洗涤:先除去鸡胚的头,爪,内脏,用Hank's 液洗一次,然后用小剪刀将鸡胚剪成1~2 毫米大小的碎块,加入Hank's 液约10 毫升,冲洗组织块,静置1~2 分钟,用毛细吸管吸去液体,同上法再洗涤二次,将血细胞充分洗去。


   (3)消化:将已洗净的组织置于三角烧瓶内,加入0.25% 胰酶溶液10~15 毫升,37 ℃水浴30 分钟,于消化期间应振荡2~3 次。由于胰酶的作用使大量细胞游离,液体变混浊。


   (4)分散细胞:取出消化瓶,以吸管反复冲打组织块,直至肉眼看不见组织块,全部成为分散细胞为止。将细胞悬液用四层纱布过滤,滤液经1000 转/分离心5 分钟后,吸去上清液,加入营养液5 毫升,制成均匀分散的细胞悬液。


   (5)细胞计数:取出0.1 毫升细胞悬液加于小试管中,加入0.9 ml Hank's 液稀释,混匀后,吸出少量悬液滴入血球计算板,用低倍镜计数,并按下列公式计算出每毫升细胞数。


   每毫升细胞数=(4大格细胞总数/4)× 104 ×稀释倍数

   

  (6)细胞分装及培养:按计算所得的细胞数,用培养液将细胞稀释成100 万细胞/ ml,接种40 孔聚苯乙烯微量培养板或细胞培养管,40 孔每孔0.l ml(含10 万细胞),加盖盖好,静置平放于CO2 培养箱中培养,细胞管每管分装0.7 ml(含70 万细胞),用胶塞塞紧,静置斜放使与平面成5°角,置37 ℃温箱中培养24~48 小时。此时在低倍镜下可见生长成单层的鸡胚成纤维细胞。


    2.  病毒接种及病毒对细胞致病变作用(CPE)的观察


    在低倍镜下,选择生成致密成单层的细胞培养管或40 孔细胞培养板,吸去培养液;培养管每管0.1 ml(细胞培养板每孔加入0.025 ml)的新城鸡瘟病毒液,分别置37 ℃温箱或CO2培养箱中使病毒吸附30 分钟,然后吸除病毒接种物,加入维持液,每管0.7 ml 或每孔0.2 ml,(含1% 小牛血清的0.5% 水解乳蛋白Hank\s 液,其他成分同营养液)置37 ℃培养。每天取出,低倍镜下观察有无细胞病变出现(细胞变圆,堆积及脱落)。注意要与不接种病毒的细胞对照作比较。


    注意事项:鸡胚单层细胞培养整个过程要求严格无菌。