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mRNA 的分离实验

点击次数:  更新时间:2018/7/7 16:27:04  

     哺乳动物细胞的绝大部分mRNA 在其3‘ 端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离 mRNA。在构建 cDNA 文库时,必须经上述纯化步骤制备 mRNA 模板。进行 Northern 杂交或 Sl 核酸酶作用图分析时,与总 RNA 相比,采用poly(A)+RNA能获得更为满意的结果。

实验原理:

      哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3‘ 端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNA。

实验步骤:

  1. 1.  用0.1 mol/L NaOH悬浮0.5~1.0 goligo(dT)-纤维素。
     
    2.  将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5~1.0 ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1 ml的oligo(dT)-纤维素最大量为10 mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量,以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。
     
    3.  用无菌的1×层析柱加样缓冲液冲洗柱床,直至流出液的 pH 值小于8.0。1×层析柱加样缓冲液为:20 mmol/L Tris-  HCl(pH7.6),0.5 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA(pH8.0),0.1%SDS。
     
    可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液:将适量无RNA酶的Tris-HCl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15 lbf/in2(1.034×105 Pa)高压下蒸汽灭菌,待其冷却至65 ℃左右时加入已在65 ℃预热30 min的10%SDS贮存液。也可以用0.05 mol/L柠檬酸钠代替Tris- HCl,然后用DEPC处理柠檬酸钠-NaCl-EDTA和SDS的混合溶液。
     
    4.  用灭菌水溶解RNA,于65 ℃温育5 min后迅速冷却至室温,加等体积的2×层析柱加样缓冲液,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。当所有的RNA溶液均进入柱床后,加1倍体积的1×层析柱加样缓冲液,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏poly(A)尾的二级结构。

     
    5.  当全部溶液流出后,将收集液置于65 ℃温育5 min,重新上样,并收集流出液。
     
    6.  用5~10倍柱床体积的1×层析柱加样缓冲液洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD 260。最后由于不带poly(A)的RNA洗过柱床,OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱体积的含0.1 mol/L NaCl的1×层析柱加样缓冲液洗柱床,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有,因此这一步骤可以省略。
     
    7.  用2~3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3~1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6),1 mmol/L EDTA(pH8.0),0.05%SDS。
     
    用于配制洗脱缓冲液的Tris-HCl和EDTA贮存液应为新近高压处理的溶液,可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理,因高压处理会使溶液产生大量气泡。
     
    8.  收集液置于透明的小容器内,测定OD260,使用前比色杯须用浓盐酸-甲醇(1∶1)浸泡1 h,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗,合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)-纤维素亲和量层析后得到的RNA中,带与不带poly(A)RNA,其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65 ℃温育3 min,迅速冷却至室温,加入NaCl至终浓度为0.5 mol/L,用同一oligo(dT)-纤维素柱进行第二轮层析。
     
    9.  收集oligo(dT)-纤维素柱层析的洗脱液,在mRNA溶液中加入3  mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3 mol/L,混匀。加2.5倍体积用冰预冷的乙醇,混匀,冰浴至少30 min。
     
    10.  于4 ℃以10000×g离心15 min,回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀(通常看不见沉淀),离心片刻,在空气中晾干核酸沉淀。
     
    11.  用少量水重溶RNA,置于比色杯内,测定OD260,使用前比色杯须用浓盐酸-甲醇(1∶1)浸泡1   h,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。
     
    12.  将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内,加3倍体积乙醇,混匀,于-70 ℃保存备用。回收RNA时,只需取出一小份贮存液,加3 mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3 mol/L,混匀,用微量离心机于4 ℃以12000×g离心5 min即可。

注意事项:

  1. 1.  OD260=1的溶液其RNA含量约为40 μg/ml。
     
    2.  从107个哺乳动物培养细胞中可获得1~5 μgmRNA,所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1%~2%。
     
    3.  现可直接从公司购买纯化试剂盒。

文章转载自丁香通