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原代细胞培养---小鼠胚胎分离实验

点击次数：  更新时间：2018/7/23 10:09:01  

实验原理：

无菌条件下切除孕鼠（已知怀孕时间）子宫，分离胚胎

实验步骤：

1．交配。将分笼的雄鼠和雌以合笼 进行交配，雌鼠3天后可进人动情期．此时交配的成功率最高。这一过程．11以有计划地进行，使胚胎在适宜的时间产生。为确定成功交配的时间需梅大早晨检查 雌以的阴栓。

2．计算胚胎发育时间：将发现阴栓 的日子定为零天．胚胎发育时间 由这一天开始计算。整个孕期约 为19~21天，分离完枯胚胎进行 细胞培养的合适时间为第l:1天， 此时胚胎已栩当大（图12.1、图 12.2)，但仍含有大显的未分化的 问充质细胞，这是培养细胞的l二 要来溉。但分离、处理超过妊娠 期·半的胚胎1.1能需要许可证 （例如在英国），所以用9~10天 的胚胎也许更可取。虽然从这种 胚胎分离的组织细胞的数目相对 少一些，但能够生长的细胞的比例较高，除了脑和心脏之外的大部分器官于妊振第9天开始形成，11天之 前很难分离。单一器官的分离在第13~14天比较容易，大部分器官于第 18天完全形成。
 

孕后12、13、14天的胚胎、12 天的胚胎（下部）取自一个小窝（三只），他们比正常情况下在此阶段的个体要大些
 

3．拉须处死小以（U.K Schedule I procedure），用70％乙醇仔细消毒其腹部 表面（图12.3a）。

4.于隔膜附近的腹中线位置横向撕开皮肤（图12.3b），向两侧翻开皮肤，显露未接触的腹壁（图12.3c）。
 

5.用无菌剪刀沿腹中线纵行剖开，显露腹腔脏器（图12.3d)，此时可见充满胚 胎的子宫位于后腹腔（图12.3e).
 

6．取出子官置于盛有 10ml 或20ml DBSS 的25ml 或 50ml 的螺口瓶内。

注意事项：以上所有步骤应在组织培养室外进行，于小型超净台内快速操作 将有助于保持无菌。不要把活体动物带入培养室因为活体动物可带入污染。若动物 尸体雷在培养室内处理，必须先浸入乙醉或用乙醉涂抹，用后尽快处理掉。
 

图12.3 小鼠解剖

解剖孕鼠取出小鼠胚胎的步骤

（a）擦洗腹部；（b）、(c）撕开皮肤，露出腹壁；（d）打开腹腔；（e）原位展示子宫；(f）取出子宫；（g）、（h）自子宫分离胚胎；(i)去除胎膜；（j）去除头部（随意地）；(k)切碎胚胎：（l）将小块组织转移至消化用的烧瓶中（温胰蛋白酶消化）；（m）或者将小块组织转移至Knlcnmcyer烧瓶中（冷胰蛋白酶消化);(n）将烧瓶放在冰里．
 

7．将未处理的子宫移入培养室，转人新的培养皿中，内含无菌的DBSS(12.3g)。
 

8．分离胚胎：

(a）用两个无菌镊子撕开子宫，注意保持镊子尖闭合，以免过度破坏子宫及 对胚胎施加过大压力（图12.3h）。

(b）将胚胎与胎膜（图12.3i）和胎盘剥离，放在培养皿的另一边，避开 血污。
 

9．将胚胎转人新的培养皿中，若有大量的胚胎要取（如 4 或 5 窝以上），可 将培养皿置于冰上（等待进一步解剖和培养，见方案12.4～方案12.8）。

本文转载自丁香园