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蛋白印迹法(四)

点击次数：  更新时间：2018/6/2 14:16:03  

三 电泳

*考马斯亮蓝法：

1. 用40%双蒸水/10%醋酸/50%甲醇的溶液固定胶中蛋白    

2. 考马斯亮蓝R-250染色室温染色4h过夜，保持摇匀     

3. 转入67.5%双蒸水/7.5%醋酸/25%甲醇摇匀脱色   

4. 蛋白被染成深蓝色。

 

四 转膜

   转膜方式有半干式和湿转两种。半干式转膜速度快，但高分子量蛋白转膜效果较差。高分子量蛋白质与胶相互作用较强，从胶中移出较难。因此，一般大于120-150kDa的蛋白用半干式转膜时，可选用碱性电转缓冲液，也可在电转缓冲液中加SDS。但SDS妨碍蛋白与膜的结合，尤其对小分子蛋白。湿转成功率高，特别适用于大分子量（大于100kDa）的蛋白。

操作步骤：

1 准备：切好的PVDF膜和滤纸置于甲醇5min，PVDF膜置于电转缓冲液浸泡10min以上。

*转一张膜需6张6cm×9cm滤纸和1张6cm×9cmPVDF膜，滤纸和膜的尺寸不能小余胶的尺寸，否则导致电流不能通过膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因手上的蛋白会污染膜。

2 加有转膜液搪瓷盘中放入转膜用的已浸过的PVDF膜和滤纸。

3 电泳结束后撬掉玻璃板取胶，除去小玻璃板，轻轻刮去浓缩胶。

4 小心剥下分离胶盖于已泡好的滤纸上。

5 200V电压，160mA稳流电，转膜1h。

6 转完后将膜和滤纸扔掉，PVDF膜右上角用剪子切断一小部分进行标记，Marker用红蓝铅笔进行标记。

7 PVDF膜放入PBS-T溶液，振荡5min×3次。