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质粒的制备、提取 启动子质粒

点击次数：  更新时间：2018/3/30 15:11:43  

一、操作前准备

1. 仪器设备

PCR仪、37℃恒温培养箱、37℃恒温摇床、水浴锅、超净工作台、高速离心机等等。

2. 试剂

过表达载体质粒（pGL3-Basic等）、限制性内切酶、胶回收试剂盒、感受态大肠杆埃希菌DH5ɑ、质粒提取试剂盒等等。

二、菌落制备主要环节

（一）扩增Lin28A启动子

1. 以HepG2基因组DNA为模板，扩增Lin28A启动子，长度1480bp。

引物：

上游引物：5′-CCGCTCGAGGGTGGTTACTCTCAAACAAGG-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTCAGAGACTCACGGCGGGACAAG-3′

分别在上下游引物上引入XhoI/Hind Ⅲ内切酶位点。

2. PCR产物回收

* 依照琼脂糖凝胶回收试剂盒操作进行。

（二）双酶切

将PCR回收产物和pGL3-Basic空载体同时进行双酶切。

1.双酶切体系

（1）DNA回收片段酶切的试剂和剂量如下：

     Xho Ⅰ                          1ul

     Hind Ⅲ                         1uL

     DNA片段（300ng）        _uL

     DDW                            20uL

（2）pGL3-Basic空载体酶切的试剂和剂量如下：

     Xho Ⅰ                          1ul

     Hind Ⅲ                         1uL

     质粒（500ng）               _uL

     DDW                            20uL

2.双酶切产物回收

依据琼脂糖凝胶回收试剂盒操作进行。

（三）连接

将回收的PCR产物连接入pGL3-Basic载体中，反应体系如下：

T4 连接酶                         1uL

5×buffer                          1uL

酶切质粒（50ng）             _ul

酶切DNA片段（100ng）    _uL

DDW                                20uL

* 16℃连接8-10h，或者室温连接10min。

（四）转化

1、将感受态细胞DH5ɑ从-80℃冰箱中取出，立即置于冰中，使其在冰中融化。

2、连接产物加入DH5ɑ感受态细胞溶液中，轻轻吹打使连接产物分布均匀。

3、冰浴30min。

4、42℃水浴散热45s。*此时切勿振荡

5、立即冰浴2min。

6、加入800ul 37℃预热的LB培养基转化的菌液中。

7、37℃，110rpm,振荡培养60min。