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RNA酶A的小鼠细胞治疗

点击次数:  更新时间:2017/8/15 16:19:15  

一、RNA酶A的小鼠细胞治疗介绍

 

RNA酶A透其次是免疫细胞治疗是一种方法,它允许显示的本地化涉及到细胞的蛋白质的RNA酶敏感的结构。这项技术是高度依赖所使用的RNA酶A的质量在我们的实验室中,我们用RNA酶A的小鼠细胞治疗表明,异染色质蛋白1(HP1)在臂间异染色质蛋白的富集取决于存在一种RNA成分。

 

二、材料与试剂


CSK缓冲液:(在-20°C贮存)


10m M的管(pH值7.0)


100 mM的氯化钠


300 MM蔗糖


3 mM氯化镁

 

三、实验步骤


1.  RNA酶制剂是从牛胰核糖核酸酶A是一种核糖核酸内切酶,专门切割单stranted RNA的。酶攻击嘧啶核苷酸的3'-磷酸基和劈开的5'-磷酸联动的相邻核苷酸。RNA酶A,它工作在辅因子和二价阳离子的情况下,可以抑制由RNA酶抑制剂。对RNA酶A的选择和准备,此协议是至关重要的。核糖核酸酶A的一些公司完全适用于分子生物学的应用程序,但它不能使用的细胞,它只是杀死他们。

 

2.  在0.01M醋酸钠(pH5.2)中的10毫克/毫升的浓度溶解RNA酶A;加热至100℃,15分钟;允许缓慢冷却至室温;通过加入0.1倍体积的1M TrisHCl(pH7.4)中,将pH调节;分装到装店在-20°C


3.  细胞提取


为了检测在细胞核的依赖于RNA的蛋白质的相互作用,细胞首先要被提取用洗涤剂。这一步可以去除而留下更紧密地结合蛋白的可溶性蛋白。

 

4.  直接贴壁细胞成长到的盖玻片


洗净3分钟,在室温下用1xPBS;洗净与CSK,缓冲液 3分钟,在室温下;孵育在CSK缓冲器 + 0.5%的Triton X-100在室温下5分钟;CSK缓冲液 3分钟,在室温下洗涤;用PBS洗两次,在室温下3分钟。


5.  RNaseA处理


对RNase A处理的Triton X-100通透细胞(RNA酶浓度,时间和温度),滴定实验,以确定最佳条件,用RNA酶A罗氏。显然的条件来进行调整,这不仅取决于的RNA酶,但也以被处理的细胞类型。在PBS中加入1 mg/ml 的RNA酶A,在室温下进行10分钟;用PBS洗两次,在室温下3分钟;在PBS中的2%多聚甲醛固定15分钟,在室温;然后进行染色。特异性的RNA酶消化已知的RNA依赖的标记,如核仁纤维,分散后处理有关的蛋白质的核糖体RNA的成熟,这是已经被监控。然而,还没有完全拧入细胞核染色几个核组分(核膜蛋白,核纤层蛋白B;剪接因子钪-35;着丝粒蛋白CENP-A,B,和C)将被保留。


(本文转载丁香通)