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提取与纯化之质粒DNA

点击次数：  更新时间：2017/8/12 17:44:31  

本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。

一、材料与试剂

1、材料：大肠杆菌

2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)

      

10 mM EDTA(pH8.0)

      

50 mM葡萄糖

      

高压灭菌，4℃保存

      

Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用

      

Solution III 5 N KAc pH4.8

      

高压灭菌，4℃保存

      

3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂

三、操作步骤

1、细菌繁殖

LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜

2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液

3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃

加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min

4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min

5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min

6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃

7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min

8、离心10 min，12000 rpm, 4℃

9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中

10、加入40 ul，3 M NaAc

11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀

12、离心10 min，12000 rpm, 4℃

13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量

四、结果与分析

超螺旋结构DNA

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