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原位杂交实验

点击次数：  更新时间：2017/3/13 10:27:59  

实验步骤

取新鲜组织，需要在发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成）

1. 重新水化和固定

（1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

（2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟

（3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

（4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟

（5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

 (1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

 (2）用等体积的HYB+取代HYB－。

 (3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

 (1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）

 (2）60℃ 温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理