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免疫共沉淀实验

点击次数:  更新时间:2017/3/11 10:00:07  

免疫沉淀的实验步骤


(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;


(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;


(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;


(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。


注意事项


1.不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。


2. 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用


3. 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:


  (1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;


  (2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;


  (3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。