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质粒图谱之火眼金睛是如何炼成的?

点击次数:  更新时间:2017/10/20 10:03:31  

质粒和载体傻傻分不清楚


质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型。


载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。细菌或病毒质粒是重组DNA技术中常用的载体。


简而言之,质粒可以说是一个统称,载体是质粒改造过用来运载的工具


选用质粒做载体的要求

以最常用的为例


(1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);


(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10 个以上的拷贝,而严谨型质粒<10 个。


(3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;


(4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr。


无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。


如何一眼看穿质粒图谱


①  复制起始位点Ori,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒),Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。


②  再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记:


Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。


tetr :可以阻止四环素进入细胞。


camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。


neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。


hygr:使潮霉素β失活。


③  看多克隆位点(MCS):它具有多个限制内切酶的单一切点(质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列,不然就一刀好几段了),便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选,最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。


④再看外源DNA插入片段大小:质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。


⑤ 是否含有表达系统元件,即启动子(promoter)-核糖体结合位点(RBS)-转录终止信号(AATAAA同时是poly A)。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。


⑥看报告基因:主要是为了能迅速检查功能基因是否表达的阳性判断,表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置。

 

⑦看质粒图谱上的箭头:它代表DNA两条链(正义链和反义链),即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上。目的基因片段进行连接。