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免疫组化技术的实验步骤和注意事项

点击次数：  更新时间：2016/12/21 11:23:12  

免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

免疫组化染色步骤（以ABC法为例）

1．切片脱蜡入水，入PBS 洗三次/15分钟。

2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 （在PAS或0.05Tris—HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室 温，30 分钟。

3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。

4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。

5．滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。

6．0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。

7．滴加第二抗体，室温15′~ 60′。

8．0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。

9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。

10．0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。

11．0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。

12．DAB—H2O2 显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）

13．自来水洗净。

14．用Mayer 苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。

15．常规脱水、透明、封固、镜检。

结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

免疫组化染色基本技术及注意事项

1．实验计划

① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。

② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。

③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。

2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）

（1）工作液：无须稀释

（2）原液：

① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；

若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。

② 原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。

③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。

④ 关于Ab保存应参照说明书。

（3）Ab浓度的选择

Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。

3．Ab滴片技术

—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要领：甩净组织周围的水。

4．PBS洗涤技术

（1）洗涤的目的

① 保证离子浓度和PH值。

② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）

（2）方法：洗三次，每次5分钟。

5．Ab孵育技术

（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。

（2）温度与时间 4℃：过夜；

37℃：2 h or 参考说明书

6．光镜控制显色方法

（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。

（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。