GST融合蛋白表达和纯化
点击次数： 更新时间：2016/11/17 10:54:00
表达GST融合蛋白
载体
pGEX-KG 大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，IPTG诱导表达
酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
构建pGEX-KG-YFG重组质粒
1、分析所感兴趣的基因(your favorite GENE, YFG)
Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合
2、确定合适的双酶切位点
对照YFG、载体多克隆位点，确定上、下游酶切位点
3、设计PCR上、下游引物
Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物
酶切位点外最多含6个碱基
3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾
3’端至少保证有10个碱基完全配对
得分(Rating)大于70
[注意]
上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框
下游引物：添加终止密码子(UAA、UAG、UGA)
4、引物合成及保存
纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳
保存：贮存浓度：100pmol/μl(100μM)，工作浓度：10pmol/μl(10μM)，-20°C保存
5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl 稀释少量 -20°C保存 引物：10pmol/μl(10μM) -20°C保存
Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb
反应体系(配制时置于冰上)
反应条件
(1) 预变性 94°C 5 min
(2) 变性 94°C 30 s
(3) 退火 待定 30 s
(4) 延伸 72°C 待定
(5) 重复2-5 25-30个循环
(6) 补平缺口 72°C 10 min
(7) 暂存 10°C
[注意]
退火温度：参考4(G+C)+2(A+T)-4(互补碱基)，参考Ta Opt(Primer Premier 5.0)
延伸时间：Taq酶：1kb/min
循环数小于30，减少错配
琼脂糖电泳检测PCR产物
0.8%有效分离范围：10~0.8kb;1.0%有效分离浓度7~0.5kb
50ml TAE加入5μl EB母液(5mg/ml)
100V，30-45min
拍照或者紫外灯下切胶回收
6、构建pGEX-KG-YFG
酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG
回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收
连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng
转化铺平板：Ampr
挑单克隆：Ampr
鉴定：小提质粒酶切 or菌体 PCR
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株 检测GST融合蛋白表达
（1）冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)
（2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng)，混匀(质粒≤感受态1/10)
（3） 冰上放置30min
（4）42°C，90s
（5） 冰上放置2-3min
（6）加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB)，37°C，250rpm，1 h
（7）4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板(Ampr)，37°C，过夜(16 h)
（8）挑单克隆菌落，5ml LB(Ampr)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
（9）稀释10倍、20倍、50倍测定OD600
（10）选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，测定OD600
（11）取100μl菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
（12） 取500μl菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4°C保存)，测OD600
（13）37°C，250 rpm，2 h(OD600：0.6-0.8)，测OD600
（14）室温放置20 min(摇床降温，30°C)
（15）取100μl作为诱导前对照，冰上放置
（16）菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM
（17）30°C，250 rpm，2 -4h(可做时间梯度)，测OD600
（18）取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50μl 1×SDS上样缓冲液
（19） 取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中
（20）加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体
（21）超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W(冰浴)
（22）超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4°C，12000rpm，离心5min
（23）超声后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
（24）超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬取25μl，加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C 保存)
（25）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
（26） 8-10%SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
（27）考马斯亮蓝染色
[注意]
(1)菌液OD值小于1即可
(2)诱导时间最好做一个梯度，2-6h
(3)诱导温度适当摸索，24°C、30°C
(4)IPTG浓度可做梯度，1mM
(5)超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠
8、测序确认
测序引物：pGEX-3通用引物
测序样品：过夜菌1ml;质粒(浓度大于50ng/μl，10μl)
9、中提质粒(Promega)
10、GST融合蛋白纯化
（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21(DE3)pLysS
（2）活化：取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释)，37°C，250rpm，过夜(16 h)
（3）取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存)
（4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)
（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置
（6） 加入IPTG，终浓度1 mM
（7）30°C，250rpm，诱导适当时间(预实验确定)
（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液
（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞
（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中(无气泡)
（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W(冰浴)
（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min
（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-8 0°C保存)；
（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上 清、超声后沉淀；
（17）考马斯亮蓝染色
（18）混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry)，取200μl加入15ml离心管中(2份)
（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清
（20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)
（21）4°C，3000rpm，离心3min
（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)
（23）10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)
（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油)，混匀
（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE
（26） -20°C保存beads
