实验材料:表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
试剂、试剂盒:细胞裂解缓冲液I、细胞裂解缓冲液Ⅱ、脱氧胆酸、浓盐酸、包涵体溶解缓冲液I、包涵体溶解缓冲液Ⅱ、KOH、PMSF、SDS
仪器、耗材:Sorvall GSA
实验步骤
材料:
1、缓冲液和溶液
2、贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录1。
3、细胞裂解缓冲液
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
4、细胞裂解缓冲液Ⅱ,
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
0.5% TritonX-100
5、脱氧胆酸
使用蛋白级的胆酸/去污剂。
6、HCl(12mol/L)(浓盐酸)
7、包涵体溶解缓冲液
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
8mol/L
0.1mol/LPMSF
缓冲液现用现配。
8、包涵体溶解缓冲液Ⅱ
50 mmol/LKH2PO4(pH10.7)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
50 mmol/LNaCl
9、KOH(10mol/L)
10、PMSF(100 mmol/L)
11、1x和2XSDS
不含DTT的1x
12、含尿素的Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)
仅限于方法2使用,请见步骤7。配制内含尿素浓度递增(如
13、酶和缓冲液
14、DNaseI(1 mg/ml)
15、溶菌酶(10 mg/ml)
16、用Tris-Cl(PH8.0)现用现配。
17、凝胶
18、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录
19、离心机和转头
20Sorvall GSA
特别配备
20、pH
备用,请见步骤
21、磨光玻璃棒
22、载体和细菌菌株
23、表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
方法
制备细胞抽提物
1.1L
注意:步骤2~4—定要在4°C
2.吸去上清,称菌体沉淀的重量,每克(湿重)菌体加入
3.每克(湿重)菌体加入
4.每克(湿重)菌体加入4 mg
5.悬液
6.裂解液室温放置,直至不再黏稠(约
纯化和洗涤包涵体
7.用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。
方法1:
下述流程是对Marston
a.细胞裂解物4°C
b.倾倒去除上清,沉淀重悬于
c.悬液室温放置
d.高速离心
e.倾倒上清,留置待用。沉淀重悬于
f.各取10ul
g.必要时继续步骤
方法2:
下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体,摘自Schoner等(1985)。
a.细胞裂解物
注意:步骤b、d
b.倾倒去除上清,每克(湿重)菌体沉淀重悬于
c.4°C
d.毎份沉淀重悬于
e.4°C
f.倾倒上清,留置待用,每份菌体沉淀重悬于100ul
g,各取10ul上清和沉淀,分别与10ul 2XSDS
h.用步骤g
i.必要时继续步骤
溶解包涵体
8.取适量步骤7
9.室温放置lh。
10.把溶液加入到9
11.用12mol/L
12.室温高速离心15 min。
13.倾倒上清,留置待用,沉淀重悬于100ul 1XSDS
14.取10ul