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从包涵体中纯化表达蛋白

点击次数:  更新时间:2016/11/16 11:40:56  

实验材料:表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

试剂、试剂盒:细胞裂解缓冲液I、细胞裂解缓冲液Ⅱ、脱氧胆酸、浓盐酸、包涵体溶解缓冲液I、包涵体溶解缓冲液Ⅱ、KOH、PMSF、SDS 凝胶加样缓冲液、含尿素的Tris-Cl、DNaseI、溶菌酶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶

仪器、耗材:Sorvall GSA 转头或相当的转头、pH试纸、磨光玻璃棒

实验步骤

材料:

1、缓冲液和溶液

2、贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录1。

 贮存液稀释至适当浓度。

3、细胞裂解缓冲液 I

 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)

 1mmol/LEDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

4、细胞裂解缓冲液Ⅱ冰冷

 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

 10 mmol/L EDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

 0.5% TritonX-100

5、脱氧胆酸

 使用蛋白级的胆酸/去污剂。

6、HCl(12mol/L)(浓盐酸)

7、包涵体溶解缓冲液 I

 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)

 1 mmol/LEDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

 8mol/L 尿素

 0.1mol/LPMSF

 缓冲液现用现配。

8、包涵体溶解缓冲液Ⅱ

 50 mmol/LKH2PO4(pH10.7)

 1 mmol/LEDTA(pH8.0)

 50 mmol/LNaCl

9、KOH(10mol/L)

10、PMSF(100 mmol/L)

11、1x和2XSDS 凝胶加样缓冲液

 不含DTT的1x 2xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存,lmol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

12、含尿素的Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)

 仅限于方法2使用,请见步骤7。配制内含尿素浓度递增(如 0.515mol/L) 0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配,不能使用任何尿素贮存液,因为尿素容易分解。

13、酶和缓冲液

14、DNaseI(1 mg/ml)

15、溶菌酶(10 mg/ml)

16、用Tris-Cl(PH8.0)现用现配。

17、凝胶

18、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)

 用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8

19、离心机和转头

 20Sorvall GSA 转头或相当的转头

 特别配备

20、pH 试纸

 备用,请见步骤 10。

21、磨光玻璃棒

22、载体和细菌菌株

23、表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

        培养1L以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

方法

制备细胞抽提物

1.1L 表达细胞培养物于预先称重的离心管中4°5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头)离心 15 min

注意:步骤2~4—定要在4°进行。

2.吸去上清,称菌体沉淀的重量,每克(湿重)菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I,轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动,使菌体悬起。

3.每克(湿重)菌体加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶,搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物(见方案1) 

4.每克(湿重)菌体加入4 mg 脱氧胆酸,继续搅动。

5.悬液 37°放置,不时用磨光玻璃棒搅动,待其变黏时每克(湿重)菌体加入 20ul 1 mg/ml DNaseI

6.裂解液室温放置,直至不再黏稠(约 30 min)

纯化和洗涤包涵体

7.用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。

方法1: Triton X-100 提取包涵体

下述流程是对Marston 等(1984) 所用方法的改进。 

a.细胞裂解物4°高速离心 15 min 

b.倾倒去除上清,沉淀重悬于 倍体积的 4°细胞裂解缓冲液Ⅱ。

c.悬液室温放置 5 min 

d.高速离心 15 min 

e.倾倒上清,留置待用。沉淀重悬于 100ul 水。

f.各取10ul 上清和沉淀,分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。

g.必要时继续步骤 溶解包涵体。

方法2: 用尿素提取包涵体

下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体,摘自Schoner等(1985) 

a.细胞裂解物 4°高速离心 15 min

注意:步骤b、和 必须在4°进行。

b.倾倒去除上清,每克(湿重)菌体沉淀重悬于 1 ml 水中。每支 100ul 装 支离心管,其余 4°C保存。

c.4°高速离心15 min

d.毎份沉淀重悬于 100ul 含不同浓度(如 0.51和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5) 

e.4°高速离心15 min

f.倾倒上清,留置待用,每份菌体沉淀重悬于100ul 水中。

g,各取10ul上清和沉淀,分别与10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。

h.用步骤确定的最佳浓度,按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀(步骤b)

i.必要时继续步骤 溶解包涵体。

溶解包涵体

8.取适量步骤的重悬细胞沉淀,4°高速离心15 min, 沉淀重悬于100ul 0.1 mmol/LPMSF(现用现加)的包涵体溶解缓冲液I

9.室温放置lh

10.把溶液加入到倍体积的包涵体溶解缓冲液II 中,室温放置30 min。检査pH 是否维持在10.7,必要时用10mol/LKOH 调节。 

11.用12mol/L 盐酸将溶液pH 调至8.0, 室温放置至少30 min

12.室温高速离心15 min

13.倾倒上清,留置待用,沉淀重悬于100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液。 

14.取10ul 上清与10ul 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和,上清和沉淀分别进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析溶解程度,继续附加方案。