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从包涵体中纯化表达蛋白

点击次数：  更新时间：2016/11/16 11:40:56  

实验材料：表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

试剂、试剂盒：细胞裂解缓冲液I、细胞裂解缓冲液Ⅱ、脱氧胆酸、浓盐酸、包涵体溶解缓冲液I、包涵体溶解缓冲液Ⅱ、KOH、PMSF、SDS 凝胶加样缓冲液、含尿素的Tris-Cl、DNaseI、溶菌酶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶

仪器、耗材：Sorvall GSA 转头或相当的转头、pH试纸、磨光玻璃棒

实验步骤

材料：

1、缓冲液和溶液

2、贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录1。

 贮存液稀释至适当浓度。

3、细胞裂解缓冲液 I

 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)

 1mmol/LEDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

4、细胞裂解缓冲液Ⅱ, 冰冷

 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

 10 mmol/L EDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

 0.5% TritonX-100

5、脱氧胆酸

 使用蛋白级的胆酸/去污剂。

6、HCl(12mol/L)(浓盐酸）

7、包涵体溶解缓冲液 I

 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)

 1 mmol/LEDTA(pH8.0)

 100 mmol/LNaCl

 8mol/L 尿素

 0.1mol/LPMSF

 缓冲液现用现配。

8、包涵体溶解缓冲液Ⅱ

 50 mmol/LKH2PO4(pH10.7)

 1 mmol/LEDTA(pH8.0)

 50 mmol/LNaCl

9、KOH(10mol/L)

10、PMSF(100 mmol/L)

11、1x和2XSDS 凝胶加样缓冲液

 不含DTT的1x 和2xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，lmol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

12、含尿素的Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)

 仅限于方法2使用，请见步骤7。配制内含尿素浓度递增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。

13、酶和缓冲液

14、DNaseI(1 mg/ml)

15、溶菌酶（10 mg/ml)

16、用Tris-Cl(PH8.0)现用现配。

17、凝胶

18、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)

 用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8。

19、离心机和转头

 20Sorvall GSA 转头或相当的转头

 特别配备

20、pH 试纸

 备用，请见步骤 10。

21、磨光玻璃棒

22、载体和细菌菌株

23、表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

        培养1L以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

方法

制备细胞抽提物

1.1L 表达细胞培养物于预先称重的离心管中4°C 以5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min。

注意：步骤2~4—定要在4°C 进行。

2.吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物（见方案1)。 

4.每克（湿重）菌体加入4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。

5.悬液 37°C 放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。

6.裂解液室温放置，直至不再黏稠（约 30 min)。

纯化和洗涤包涵体

7.用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。

方法1: 用Triton X-100 提取包涵体

下述流程是对Marston 等（1984) 所用方法的改进。 

a.细胞裂解物4°C 高速离心 15 min。 

b.倾倒去除上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4°C 细胞裂解缓冲液Ⅱ。

c.悬液室温放置 5 min。 

d.高速离心 15 min。 

e.倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于 100ul 水。

f.各取10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。

g.必要时继续步骤 8 溶解包涵体。

方法2: 用尿素提取包涵体

下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自Schoner等(1985)。 

a.细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。

注意：步骤b、d 和 f 必须在4°C 进行。

b.倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于 1 ml 水中。每支 100ul 装 4 支离心管，其余 4°C保存。

c.4°C 高速离心15 min。

d.毎份沉淀重悬于 100ul 含不同浓度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5) 

e.4°C 高速离心15 min。

f.倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于100ul 水中。

g，各取10ul上清和沉淀，分别与10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。

h.用步骤g 确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤b)。

i.必要时继续步骤 8 溶解包涵体。

溶解包涵体

8.取适量步骤7 的重悬细胞沉淀，4°C 高速离心15 min, 沉淀重悬于100ul 含0.1 mmol/LPMSF(现用现加）的包涵体溶解缓冲液I。

9.室温放置lh。

10.把溶液加入到9 倍体积的包涵体溶解缓冲液II 中，室温放置30 min。检査pH 是否维持在10.7，必要时用10mol/LKOH 调节。 

11.用12mol/L 盐酸将溶液pH 调至8.0, 室温放置至少30 min。

12.室温高速离心15 min。

13.倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液。 

14.取10ul 上清与10ul 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度，继续附加方案。