PCR技术研究 您的位置：首页 > 实验方法 PCR技术研究

实时 RT-PCR 实验

点击次数：  更新时间：2018/7/7 16:34:10  

     本方法使用Superscription反转录系统合成cDNA。进行实时PCR时，FAM或JOE荧光基团既可以标记正向引物，也可以标记反向引物。可以用Trizol试剂提取RNA或按第10章描述的方法提取RNA。样品中的基因组DNA用DNaseI消化掉（参照第10章）。本实验来源于PCR实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验步骤：

1. —、材料
   
   1. 缓冲液、溶液和试剂
   
   ①10ul 消化体系的组分。
   
   RNA 模板（最多 1ug/10ul)                             xul
   
   10XDNA 酶缓冲液                                           1ul
   
   DNA 酶 I，1U/ul(Invitrogen18068-015)           1ul
   
   DEPC 处理的水                                              8~xul
   
   ②20ul 反转录体系的组分。
   
   oligo(dT)12~180.5ug/ul                                   0.5ul
   
   Random Hexamer50ng/ul                                 0.5ul
   
   RNA 模板（最多 1ug)                                      xul
   
   10X 缓冲液                                                      2ul
   
   (20 mmol/LTris-HCl、pH8.4，500 mmol/LKCl，25 mmol/LMgCl₂)
   
   25 mmol/LMgCl₂                                               4ul
   
   10mmol/LdNTP                                                 1ul
   
   0.1mol/L 二硫苏糖酵（DTT)                              2ul
   
   RNA 酶 OUT(40U/u1)1ul
   
   SuuerscriutⅡ(50U/ul) 反转录系统（Invitrogen11904-018)1ul
   
   25 mmol/LEDTA                                                 1ul
   
   DEPC 处理的水                                                  补足到 20ul
   
   二、方法
   
   1.把上述的 10ul 消化体系混匀，25°C(室温）孵育 15 min, 然后加入 25 mmol/LEDTAlul，然后 65°C 孵育 15 min，以使 DNA 酶 I 失活。
   
   2.每次进行 RT-PCR(20ul) 时，PCR 管应放在冰上混合各种成分。逬行多个反应时除了 RNA, 可以把所有的试剂混在一起，然后分装。反应条件：25°C 孵育10min，42°C 保持 30~50 min,70°C 再保持 15 min, 最后在冰上冷却。
   
   3.反转录完成后，最好加入 1ulRNA 酶 H,37°C 孵育 20 min 以消化剩余的 RNA。用上面所述的Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 反转录得到的 cDNA, 即可用作实时 PCR 的模板，也可于-20°C 保存以备将来之用。

文章转载自丁香通