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酵母前体mRNA剪接提取物实验

点击次数：  更新时间：2018/7/31 14:32:04  

实验原理：

剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。

实验步骤：

1. 匀浆原生质球获取整细胞提取物

为尽可能得到有最大活性的提取物，要以最快的速度操作直至透析。

(1) 1 L 的酵母细胞培养物过夜培养到对数生长期的中后期。首先在 125 ml 或者 250 ml 的烧瓶中过夜培养 10~50 ml 酵母，第二天将其转移到 1 L YPD 中。使培养物在 30℃，以转速 250~300 r/min 培养过夜，使其密度达到 3X10⁷~5X10⁷/ml。对于酵母菌株 EJ101，30℃ 用 YPD 培养，倍增时间为 90 min。

(2) 收集酵母细胞。在高速离心机中 1200~1500 g 离心 5 min 收集细胞。采用 100 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重悬细胞并再次离心，再采用 30 ml 的 SB+30 mmol/L DTT 重悬细胞沉淀，室温放置 15 min。在 30 mmol/L DTT 中的孵育对后面的原生质球的形成十分重要。1500 g 离心 5 min，用 30 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重悬细胞并转入无菌的 120 ml Erlenmeyer 烧瓶。

(3) 酶解酶孵育细胞并监测原牛质球的形成。取 20 μl 两份细胞，将一份加到 1 ml 的等渗溶液中，另一份加到 1 ml 的裂解液中，通过测 λ₅₀₀ 的光吸收值来监测细胞的裂解。在细胞培养瓶中加入 250 μl 的酶解酶-100T 溶液，30℃ 50~60 r/min 缓缓摇 40 min。每 10~15 min 取出 20 μl 两份，分别加入 1 ml 的等渗溶液和裂解液中，测 λ₅₀₀ 的吸收值以监测原生质球的形成。当裂解液中的光吸收值为等渗溶液中光吸收值的 20% 或更少时，表明酶解达到要求。

(4) 此前一步操作均需在冷室中进行以保持样品冷却。设备（包括吸管、转子和溶液）均要在冷室中过夜预冷。

(5) 匀浆裂解原生质球。用一无菌硅烷化的玻璃棒轻轻地使原牛质球重悬于冷的缓冲液 A 中，1 L 培养物（4X10⁷~5X10⁷ 细胞/ml）用 8 ml 缓冲液 A。然后将原生质球转移到一冷的 7 ml 或者 14 ml Dounce 匀浆器中，匀浆器置于冰上匀浆 5~10 次。

(6) 0.2 mol/L 氯化钾处理匀浆液以从核中释放剪接因子。匀浆液倒入 15 ml 带刻度的一次性无菌圆锥离心管中，记下匀浆液的体积。如果在匀浆液中有大量气泡，用冷却的台式离心机短暂离心（2 min）以消除气泡。匀浆液倒入置于冰上的带有一个小搅拌子的 25 ml 玻璃烧杯中，缓缓搅动（约 60~120 r/min）10 min。用吸头慢慢（2 min）加入 0.9 倍体积冷的 2 mol/L KCl 至终浓度为 0.2mol/L，再缓缓搅动 30 min。

(7) 通过两次离心沉淀细胞碎片和细胞器，将匀浆转移到 10 ml 或者 30 ml 的螺帽 Oak Ridge 试管并在 4℃ 以 33000 g 离心 30 min 以沉淀大的碎片。在冷室从转子中取出试管，吸取上淸转移到一个厚壁聚碳酸酯的带螺帽试管中，然后于 4℃ 100000 g 离心 1 h。

(8) 透析提取物。把离心机转子移到冷室中，小心取出试管并放到试管架上，打开盖子。样品分为三层：薄的上层包括脂类和脂蛋白；厚的中间层为澄清的淡黄绿色，包括大部分的剪接活性物质和一些核糖体；底层则为清晰的淡棕色，包括细胞器、核糖体和大的细胞碎片。从缓冲液 D 中取出透析袋，戴上手套，挤掉多余的液体，以夹子封闭一端。用冷的无菌巴斯德吸管吸取黄绿色的中间层液体，小心操作，避免吸到上层或底层。提取物吸到透析袋中，约 6~8 ml。挤去袋中的空气，用夹子在接近提取物的地方夹住透析袋。将透析袋置于一个装有 1 L 缓冲液 D 和一个无菌磁力搅拌子的无菌烧杯中。将烧杯放在冰槽中，周围放上冰，冰槽则放在冷室中的磁力搅拌器上。1.5 h 后更换缓冲液 D，共搅拌透析 3 h。提取物更多时可增加缓冲液 D。

(9) 离心去除透析时产生的沉淀。透析后，提取物的量可能减少 1~2 ml，从透析缓冲液中取出透祈袋，用纱布擦去袋外的液体，打开上端的夹子，用一冷的无菌巴斯德吸管吸出提取物转移到一冷的 Oak Ridge 试管或者几个冷的微量离心管中。在 4℃ 以 12000~14000 g 时离心 10 min。

(10) 保存提取物。以每管 100 μl，200 μl 或者 500 μl 将提取物分装到置于冰上的微量离心管或冻存管中。快速冷冻后在液氮或者 -70℃ 冰箱中保存。

(11) 1 L 酵母培养物可得到 6 ml 提取物，每毫升约含蛋白质 20~30 mg。

2. “冷冻断裂” 法获得全细胞提取物

(1) 如上所述方法培养酵母细胞。以 1500 g 在 4℃ 离心 10 min 收集细胞。

(2) 准备细胞。将细胞在 50~100 ml 冷的 AGK + PMSF 缓冲液中重新悬浮，在 4℃ 以 1500 g 离心 10 min，从这一步开始样品要保持冰冷。倒出上清并加入 20 ml 新配制的冷 AGK+ PMSF 缓冲液重悬浮细胞，将细胞悬液转移至无菌的 50 ml 聚丙烯刻度离心管中。在台式离心机或者高速离心机里于 4℃ 1500 g 离心 10 min，倒出上淸，细胞沉淀约为 0.5 ml，加入 0.4 倍体积的 AGK+PMSF 缓冲液，以硅烷化并烤过的玻璃棒重悬细胞，悬浮液十分黏稠，将其放置在冰上。

(3) 快速冷冻悬液，用巴斯德吸管将悬浮液滴到液氮中以形成直径为 0.2~0.5 cm 的小球。在冷冻细胞悬液之前，将研钵和研杵放到空的苯乙烯泡沬冰槽中，把液氮倒入研钵内、外并等其停止剧烈冒泡后，使装有半研钵液氮的研钵浸入 2 cm 深的液氮中。为了便 于吸取黏稠的细胞悬液，可折断巴斯德吸管的顶端以使其吸口变大。吸管顶端至少高出液氮表面 5 cm（防止悬液在吸管中冷冻），将悬液滴加入研钵中的液氮里。

(4) 所有的悬液均冻成小球后，磨碎提取物。一手戴隔热手套握住研钵，轻轻地研磨液氮中冻结的小球以使它们变成小的碎片，然后研磨使之变成粉末。当研钵中的液氮蒸发后，悬液可以被研磨成十分细的粉末，粉末越细提取物的活性越好。研磨时间通常是 20~30 min，即使液氮在研磨的最后阶段从研钵中蒸发。要不断补充液氮到冰槽中使研钵浸在 1~2 cm 深的液氮中。

(5) 把研磨后的细胞粉未转移到试管中融解。在液氮中冷却一个小勺，室温下用它将研磨后的细胞粉未转移至有螺帽的 Oak Ridge 试管中，使研磨过的悬液在冰上融化，间歇涡旋振荡试管。

(6) 继续处理如操作1 “勾浆原生质球获取整细胞提取物” 中第 (7)~(11) 步所述。

(7) 1 L 细胞培养物可获得约 3~4 ml 提取物。

3. 提取物的剪接分析

(1) 制备用于剪接分析实验的放射性标记的前体 mRNA

① 转录

A. 40 μl 体外转录反应体系得到的转录产物可进行 6~10 次剪接分析（10~15 个反应），转录产物应在两周内使用。

B. 制备用于转录的 DNA 模板。选用合适的内切酶在 200 μl 反应中酶切 50 μl DNA（约 50~100 μg）以制备线状 DNA。加入 10 μl 4 mol/L NaCl 将 DNA 溶液中的 NaCl 浓度调整为 0.2 mol/L。分别用 Tris-EDTA平衡酚、氯仿：异戊醇抽提，加入 3 倍体积的无水乙醇使 DNA 沉淀。用 70% 乙醇洗 DNA 沉淀，真空干燥后用 50 μl 的 1X TE 溶解。于 -20°C 保存。

C. 进行转录反应。对于一个 40 μl 反应体系，按下列顺序在室温下把下列试剂加到一个微量离心管中：6 μl 无菌水，4 μl 0.1 mol/L DTT，4 μl 10X 转录缓冲液，4 μl 10X NTP，4 μl 30% PEG₈₀₀₀，2 μl RNsin，4 μl DNA （1~2 μg），8 μl [ α-³²P ] UTP 和 4 μl T7 RNA 聚合酶。37℃ 温育 2 h。再加入 2 μl RNA 聚合酶温育 1 h。

D. 三氯乙酸沉淀法测定放射性同位素的掺入效率。取出 2 μl 反应液并加入 10 μl 的 E.colo tRNA ( 10 mg/ml )，加入 500 μl 的 10% TCA 并在冰上孵育 10 min。然后把小管中的混合物加到真空过滤装置的玻璃纤维滤膜上，用约 1 ml 的 5% TCA 冲洗试管并将其加到滤器中，先后用 5ml 的 5% TCA 和 5 ml 的 95% 乙醇再清洗滤膜两次。滤膜干燥后，置于装有 15 ml 水的闪烁瓶中，用液体闪烁计数器测量放射性强度。好的转录反应每 2 μl 应有约 2X10⁶ Cerenkov/min。其余产物 -20℃ 可保存 2 天。

E. 准备电泳的样品。加等体积（40 μl ) 的上样缓冲液到反应中，65℃ 加热 10 min 使 RNA 变性并立即置于冰上。

② 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

A. 淸洗玻璃板和硅烷化带凹口的玻璃板，使用 1.5 mm 厚的垫片。

B. 灌制凝胶。戴上手套，取 70 ml 的 5% 丙烯酰胺溶液加入烧杯中，加入 TEMED 和 0.45 ml 10% APS 并混匀，将其倒入电泳装置的玻璃板间的缝隙直到与带凹口的玻璃板的顶端平齐，操作时避免产生气泡。插上梳子，将凝胶放在工作台上至少凝集 1 h。如果当天不用，室温下凝胶可放在有一湿纸巾的密封袋中保存 1~2 天。

C. 进行凝胶电泳。在电泳槽中注满 1X TBE。保持电压恒定，以大约 60~65 mA 电流进行预电泳 20 min，使凝胶玻璃板温度达到 40~45℃（摸起来相当热），不要让它的温度变得更高，否则玻璃板将会发生断裂。

D. 上样并电泳。关掉电源，冲洗上样孔，然后上样。以 55~60 mA 电流电泳约 1.5 h，直至溴酚蓝泳出凝胶。小心地从下层容器中取出放射性的缓冲液并且按照放射安全程序处理。在上层容器中几乎没有放射性，缓冲液倒入水槽。取出垫片并将凝胶玻璃板冷却到室温，将两块玻璃板分开，凝胶应该附着在无凹口的玻璃板上，以塑料膜包裹凝胶和玻璃板。可以将凝胶-玻璃板在 -20°C 冷冻保存，于 24~48 h 后解冻以完成转录产物的处理。

③ 提取和纯化转录产物

A. 放射自显影。在暗室里，取一张 X 射线片放在干净的纸上，将凝胶-玻璃板（凝胶面朝下）放在 X 射线片上曝光 2 min。将暗盒盖在凝胶上，不要盖住上样孔，在离其 4~5 英尺（1 英尺=30.48 cm) 的地方用一小的闪光灯闪 1~2 s，这将使上样孔的轮廓曝光在 X 射线片上，这可以通过对齐凝胶和 X 射线片上的影像以对转录产物进行定位。曝光 2 min 后冲洗 X射线片。

B. 定位并切下有转录产物的凝胶带。将 X 射线片与凝胶-玻璃板（凝胶面朝上）对齐以定位转录产物。戴上手套，用干净的刀片切下目的带，避免切下多佘的凝胶。从带上去除包裹的塑料膜，将切出的带放入一次性聚丙烯管中。

C. 用压碎浸泡法提取转录产物。用无菌硅烷化的玻璃棒将切下的凝胶挤成碎片，然后加入 1.5 ml 的洗脱缓冲液。密封后在 37℃ 摇 4 h（或者 4°C 摇过夜）。室温下用台式离心机以最大速度离心 10 min 以沉淀凝胶碎片，吸取上清（包括放射性的转录产物）并通过 Quicksep 柱过滤到 15 ml Gorex 试管中。加 1 ml 的新配制的提取缓冲液到挤碎的凝胶中，混合 15~30 min，然后重复离心和过滤过程，这可以回收约 60~80% 的放射性转录产物。

D. 用氯仿和苯酚抽提转录产物。用两倍体积 NaAc-EDTA 平衡酚来抽提上清液，室温下 11420 g 离心 10 min 以分离水相和有机相。将上层的水相转移到一干净的 Corex 试管中。用两倍体积的氯仿：异戊醇再进行抽提，水相转移至干净的 Corex 试管中。

E. 沉淀转录产物。加 3 倍体积的无水乙醇，并在干冰上孵育 10 min 或者在 -20℃ 过夜。4°C 11420 g 离心 10 min 以沉淀 RNA。沉淀可能不可见，但可以采用盖格计数器进行检测。小心倒出上清并加入约 5 ml 70% 乙醇洗沉淀，重复离心然后倒掉上清，真空干燥沉淀。

F. 在乙酸铵和乙醇中再沉淀 RNA 以去除剩余的盐分并保存转录产物。用 400 μl 的无菌水溶解 RNA 沉淀，将溶液转移至加有 200 μl 7.5 mol/L NH₄Ac 的小离心管中并混合。以每份 200 μl 分装到 3 个离心管中，并且加入 3 倍体积（600 μl）的无水乙醇再次沉淀 RNA。-20℃ 保存。

G. 每 3~5 天取一管转录产物，在微量离心机里于 4°C 离心 10 min 沉淀转录产物，750 μl 70% 乙醇洗涤沉淀。室温下于旋转真空浓缩仪中干燥，最后溶于 50 μl 的水中，放在冰上。取出 2 μl 的转录产物加入装有 1 ml 水的 1.7 ml 微量离心管里，将其放在无盖的闪烁瓶中，用闪烁计数器计数。余下的 48 μl 转录产物用无菌水稀释到 20000~40000 Cerenkov cpm/μl，储存于 -20°C。取用转录产物时应放在冰上。

(2) 基本剪接分析

① 剪接分析前先灌制凝胶。按前述方法装配凝胶玻璃板，采用 0.38 mm 厚垫片和梳子并灌制 7.5% 的丙烯酰胺凝胶。

② 使用前将冷冻的提取物在冰上融化，并且放置在冰上。
③ 在提取物融化的同时，准备剪接反应系统。在冰上按下列顺序添加溶液：6.8 μl 水，1.5 μl 1mol/L 磷酸钾缓冲溶液（pH 7.4)，2.5 μl 30% PEG₈₀₀₀，0.75 μl 的 0.1 mol/L MgCl₂，0.5 μl 100 mmol/L ATP，0.5 μl 100 mmol/L DTT 和 2.5 μl 转录产物，然后充分混合。

④ 起始和终止反应。添加 10 μl 的提取物到前面准备的剪接反应系统中起始反应，在 25 μl 反应体系中，各成分的终浓度分别为 60 mmol/L 钾，3% ( m/V) PEG₈₀₀₀，3 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L ATP，20 mmol/L KCl，8 mmol/L HEPES，80 μmol/L EDTA，2.2 mmol/L DTT，8% ( V/V）甘油，0.4 nmol/L 前体 mRNA 和 40~80 μg 提取物。快速混合各组份并置于 23℃ 水浴中。加入提取物 15 min 和 30 min 后分别取出 10 μl 反应液加入 6 μl 终止液（室温）中。终止后的样品可在室温下保持直到剪接反应完成，或在 -20℃ 保存备用。

⑤ 从样品中提取 RNA。用蛋白酶 K 在37℃ 温育提取物 30 min 以降解其中的蛋白，加入 200 μl 50 mmoI/L NaAc ( pH 5.4)，10 mmol/L EDTA，然后用 750 μl 的苯酚/氯仿/异戊醇 ( 苯酚以 NaAc-EDTA 平衡）抽提，在水相中加入 3 倍体积（大约 1000 μl）的无水乙醇，干冰上 10 min 或者在 -20℃ 2 h 甚至过夜以沉淀 RNA。

⑥ 准备 RNA 样品。采用微量离心机于室温以 12000~14000 g 离心 10 min 沉淀 RNA，小心倒出上清，用 70% 乙醇洗 RNA 沉淀并于室温下用旋转真空浓缩仪干燥。用新鲜的剪接分析上样缓冲液溶解 RNA 沉淀，65°C 加热样品 5~7 min，立即置于冰上。

⑦ 上样并电泳。干燥样品时，在电泳槽中加入 1X TBE，在 30 mA 和大约 500V（恒压）的条件下预电泳约 15 min 使凝胶变热。每孔加 4~6 μl 的样品并在 25~30 mA 和大约 600V 的条件下开始电泳。由于电流在预电泳时稍有下降，有必要提高电压使电流维持在 25~30 mA。电泳时间与前体 mRNA、剪接反应产物和中间产物的迁移率，以及聚丙烯酰胺凝胶的浓度有关，这需要通过预实验来确定。

⑧ 取出凝胶，在室温下冷却玻璃板，然后分离玻璃板。凝胶应该留在没有凹口的玻璃板上。切下稍大于凝胶的一张 Whatman 3 MM 滤纸，放在凝胶上并使凝胶紧紧附着到纸上。将玻璃板反过来，小心取下玻璃板，而凝胶粘在纸上。用塑料保鲜膜包裹凝胶，并在带增感屏的暗盒中于 -70℃ 曝光 X 射线片 5~8 h。

⑨ 当需要进行多次曝光时，应干燥凝胶以防止 RNA 扩散。将凝胶纸放入 10 倍体积的 15% 甲醇，5% 乙酸中，并在室温下缓缓摇半小时以沉淀 RNA 并去除凝胶中的尿素。在凝胶干燥器中以 80℃ 干燥凝胶 0.5~1 h。

(3) 评估提取物的活性

一般说来，高活性的酵母提取物在 23℃ 时 30 min 可剪接大约 50% 的放射性标记肌动蛋白前 mRNA，使其成为成熟的 mRNA。

本文转载自丁香园pH