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质粒提取（一）

点击次数：  更新时间：2018/4/12 16:51:04  

质粒提取

（一）摇菌培养

1. 1. 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。

2. 2. 置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。

3. 3. 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。

4. 4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。

5. 5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。

（二）收获细菌并裂解

1. 1.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。

2. 2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。

3. 3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。

4. 4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。

5. 5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。

6. 6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。

7. 7.室温，1500rpm，高速离心15min。  

8. 8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。

9. 9、弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。

10. 10、重复上一操作。

11. 11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。

12. 样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。