亲和层析实验
点击次数： 更新时间：2018/10/16 14:23:28
一、实验步骤：
1. 准备一支活化后被淬灭的Sepharose预柱（5 ml 柱床）和一支Ab-Spharose免疫亲和层析柱，并将它们串联起来。
2. 以冰冷TSA溶液重悬50 g 细胞至1~5×108细胞/ml，或往收集的细胞或组织匀浆中加入1~5倍体积的TSA。再加入等体积的冰冷裂解缓冲液，于4℃搅拌1 h。
3. 以4 000 g 离心10 min，除细胞核，轻轻倒出上清，保留之。4. 对于提纯膜抗原，在去细抱核的上清中加入0.2倍体积的5%脱氧胆酸钠，于水浴或 4℃放置10 min，转移至quick-seal离心管100 000 g 离心1 h，小心移出上清并保留之。
5. 将预柱连接于免疫亲和层析柱。
图一、免疫亲和层析柱
6. 依次用下列缓冲液洗柱子：
10倍柱床的洗涤缓冲液
5倍柱床的Tris缓冲液，pH8.0
5倍柱床的Tris缓冲液，pH9.0
5倍柱床的三乙醇氨溶液
5倍柱床的洗涤缓冲液
7. 将上清（保留一些样品待分析用）上样于预柱，让它们以5柱床/h 的流速流过预柱和免疫亲和层析柱，按加样上清体积的1/10~1/100分部收集穿透液。
8. 用5倍体积的洗涤缓冲液洗柱子，然后关闭两根柱子的止水阀。拆离亲和柱与预柱的连接，打开亲和柱的止水阀，让柱床上面的液体流至柱床表面。
9. 依次以下列溶液洗柱子，并分部收集流出组分：
5倍体积的洗涤缓冲液
5倍体积的Tris缓冲液，pH8.0
5倍体积的Tris缓冲液，pH9.0
10. 以5倍体积的三乙醇胺溶液洗脱，将每一个柱床体积的洗脱液收集于含0.2体积的1 mol/l Tris·Cl 缓冲液，pH6.7的试管中，以中和冼脱液。
11. 以5倍体积的TSA溶液洗柱子。
12. 分析含抗原的洗脱液组分：每份洗脱液取50 μl SDS-PAGE银染分析。取0.5~ 1 ml 上柱样品和有代表性的穿透流出液及洗脱液以Ab-Sepharose免疫共沉淀，并接着进行SDS-PAGE和银染检测以确定柱子是否已被饱和
二、注意事项：
在每次更换缓冲液时，按下述过程洗免疫亲和柱：
1. 关闭止水阀并打开注于上端的帽子。
2. 用一注射器连接于来自缓冲液贮槽的输液管的出口处，吸去所有液体。
3. 将管子移至盛在另一贮槽中的另一种洗柱缓冲液中，用注射器抽吸，使管子充满液体，取走注射器，调整流速，并用此缓冲液冼柱子的内壁。
4. 打开止水阀，让柱子的缓冲液流至往床水平面，放松柱子的上帽让缓冲液流下到柱床以上几厘米的水平，收紧帽子，开始洗涤或洗脱
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