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WB图跑的太丑？教你五招跑出漂亮大分子图

点击次数：  更新时间：2018/1/4 10:50:57  

实验原理：

Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。经过 PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验方案：

 

配胶 → 样品处理 → 电泳 → 转膜 →封闭及杂交 → 发光鉴定 → 增加敏感性 → NC膜的多次使用

跑图不美观:

一、杂带太多：

1、目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带通过去修饰确定蛋白实际大小。

2、目的蛋白有其他剪切体

3、样品处理过程中目的蛋白降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

4、上样量过多

5、一抗不纯

二、信号弱或无信号

1、蛋白未转到膜上

（1）转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率；（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原）

（2）确保转膜过程中胶与膜完全接触；

（3）确保转印夹层排布正确；

（4）确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜；

（5）确保转印部件在电印迹过程中未过热；

（6）使用正对照和/或分子量Marker；

（7） 优化转印时间和电流；

（8）确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。 （注意：许多蛋白不能在还原状态下进行）

2、蛋白未完全结合到膜上

3、抗体不足

4、抗体浓度太高

5、抗原不足

6、检测样本目的蛋白不表达或低表达

7、二抗与一抗不匹配

8、洗膜过度

跑图小技巧

一、选对凝胶

3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶的过程中，PH还有上升的趋势，可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋白的还原性。

Tris-Acetate 凝胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。 跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

二、凝胶浓度

既然选择了Tris-Acetate 凝胶，还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔，所以我建议使用低百分比的凝胶，如7％。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶，梯度凝胶非常适合新样本。

三、提高转移buffer中的SDS，减少甲醇

转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生。 为了进一步确保蛋白质不会沉淀，考虑添加SDS至终浓度为0.1％。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。

 

四、选择合适的膜

膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜。如前面所说，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。两种类型的膜都有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。

五、增加转印时间

在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。我建议湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转印过夜。