蛋白组学 您的位置：首页 > 实验服务 蛋白组学

重组杆状病毒的纯化实验

点击次数：  更新时间：2017/9/8 16:25:50  

杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90~180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。

实验材料

杆状病毒

试剂、试剂盒：琼脂牛血清

仪器、耗材：培养瓶冻存管

实验步骤

1.  制备病毒上清的系列稀释液，该病毒上清获得自在无血清完全培养液中转染 pAC360β-gal DNA的细胞。在含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物下病毒形成蚀斑。

2.  当蚀斑形成后，用灭菌巴斯德吸管挑取一个分离较好的蓝色蚀斑，并将琼脂糖块移入 一支含有1 ml 无血清完全培养液的无菌试管中。在旋涡混合器上剧烈篱荡，并用无血清完全培养液制备10-1、10-2和10-3的系列稀释液。

3.  用含150 μg/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物蚀斑测定病毒（有助于发现重组子），重复蚀斑试验，直到获得纯的重组病毒贮液。

4.  用无菌吸管挑取一个纯的重组蚀斑，将琼脂糖块移入一含2.5×106 Sf9细胞和5 ml 完全培养液（含10%胎牛血清）的25 cm2 培养瓶中。于27℃温育4~5天直到大多数细胞被感染。

5.  确定病毒滴度（应在5×107~1×108  pfu/ml之间）。 

6.  加入1 ml 该毒种贮液于一支1.5 ml 螺口冻存管中，于-80℃可长期保存，于4℃保存剩余的液体（标记为初代毒种液）。从初代毒种液中生产大批病毒贮液并滴定之。