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PCR一般步骤

点击次数：  更新时间：2017/8/9 14:30:18  

PCR一般步骤

(一)总RNA提取

取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中，按100g:3ml的比例加入Trizol试剂，严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。

(1)加Trizol（按3ml/100mg组织，宁多勿少）置于玻璃匀浆器中匀浆后，冰浴10-15min。

(2)移入1.5mlEP管中，4oC 13000g离心10min。

(3)上清液移至另一EP管中，室温放置10-15min。

(4)加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，振荡15s，室温置5min。

(5)4oC 12000g离心15min。

(6)仔细吸取上层水相，移至新的EP管中。

(7)加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，振摇，置室温10min。

(8)4oC 12000g离心10min，EP管底部可见白色沉淀物。

(9)弃上清，纸巾吸干，加入75%乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀。

(10)4oC 11000g离心5min。

(11)吸尽乙醇，空气干燥10min（可离心加快干燥，尽量吸尽离心液体）。

(12)半透明时将RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混匀），-20oC冻存备用。

(13)所提取的总RNA用核酸蛋白分析仪分析RNA含量和纯度，所有标本260/280nm吸光度的比值均为1.8-2.0。

(14)取所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的28s和18s两条rRNA。

(二)逆转录反应

 DEPC水 9ul

dig primer 1ul

5×buffer 4ul

10M dNTPmix 2ul

RNA酶抑制剂 1ul

总RNA 2ul 70oC 5min

逆转录酶 1ul

 

20ul 42oC 60min(+?)

70oC 10min

4oC ∞

(三)PCR反应

DEPC水（可用高压双蒸水） 17.5ul

10×Taq buffer 2.5ul

MgCl2 2.0ul

10M dNTP Mix 0.5ul

上游引物 0.5ul

下游引物 0.5ul

Tap酶(5u/ul) 0.5ul

总CDNA 1.0ul

25ul

PCR仪参数设置

 

94 oC

5min 94 oC ? oC 72 oC

30s 45s 45s 72oC 4oC

7min ∞

(四)电泳

(1)20ml 0.5×TBE

 0.3-0.4g琼脂糖

煮沸，配成1.5-2.0%琼脂糖凝胶（RNA为1.0%）

(2)冷切至60 oC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室温冷切30min

(3)拔梳，加入4ulPCR产物+1ul上样缓冲液

(4)电压100-135V

(5)UVP成像系统观察

试剂配制

 5×TBE配制方法（1L计）

Tris-Base 54g

硼酸 27.5g

EDTA 3.72g

加双蒸水至1L

2%琼脂糖凝胶配制方法

琼脂糖 0.4g

0.5×TBE 20ml

 

EB 4ul

方法的改进版：室温冷切10min，放至4oC冰箱20min

相关技巧

1.注意反应体系的一致，可分装

2.先P内参，检验CDNA的完整性

3.首先考虑退火温度

4.注意引物的设计

5.若目的条带无法到达指定位置，可先或晚于MAKER电泳

6.通过加量或减量PCR产物来达到灰度的调整

7.必要时可行标本间替代

8.可设计相应大小的内参来达到最终目的

9.2度水浴箱的妙用

10.必要时进行相关技术处理