蛋白质表达分析 您的位置：首页 > 实验方法 蛋白质表达分析

免疫球蛋白提取：连续提取免疫球蛋白

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:30:37  

（一） 试剂 及配制

1．饱和硫酸铵液

2．各种磷酸盐缓冲液

⑴ 0.2mol/L原液

A液：0.20Mol/L NaH 2 PO 4 液

NaH 2PO4 ·H 2 O 31.20g

H 2 O 1 000ml

B液：0.20Mol/L Na 2 HPO 4 液

Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.7g

H 2 O 1 000ml

⑵ 0.10Mol/L pH8.0PB液

A液： 53ml

B液： 947ml

H 2 O 加至 2 000ml

⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液

取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml，加H 2 O至2 000ml

⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液

取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml，加水至2 000ml。

⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液

取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml，加水至2 000ml。

⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液

A： 920ml

B： 80ml

H 2 O 加至 2 000ml

⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液

a液.0.40Mol/L NaH 2 PO 4 液

NaH 2PO4 ·2H 2 O 62.40g

H 2 O 加至 1 000ml

B液.0.40Mol/L Na 2 HPO 4 液

Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 143.4g

H 2 O 加至 1 000ml

取a液 960ml

b液 40ml

混合即可。

⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS液

取0.10Mol/L pH8.0 PB液 100ml

NaCl 8.20g

H 2 O 加至 1 000ml

3．DEAE-纤维素(细粒级)

4．SephadexG200

（二）操作方法

1．取一定量的 血清 ，加等量的生理盐水，然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液，使成40％的饱和度,静置30min。

2．10 000r/min离心10min，去上清。

3．加入一定量的生理盐水，使沉淀溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使成40％饱和度。10 000r/min离心10min，去上清。

4．再重复步骤3一次。

5．将沉淀以少量生理盐水溶解，透析，除盐浓缩。

6．制备DEAE-纤维素柱，以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。

同时制备SephadexG200凝胶柱，以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并进行洗脱。

7．以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白液为IgG。

8． 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgE，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgE。

9． 以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgA，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgA。

10．以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脱，洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。

11．以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脱，得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200，收集第二峰即为纯IgM。