反向PCR实验步骤

inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。

基本步骤如下：

1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。

a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；

b. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；

c. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。

2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。

根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：

Buffer for EcoR I 2μl

Genomic DNA 3μl

EcoR I 0.5μl （10u/μl）

ddH2O 14.5 μl

20μl

37度过夜，电泳检测酶切效果。

3、回收DNA

① 将酶切产物转到1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250μl；

② 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1min；

③ 最大速度（13, 000 rpm）离心1min；

④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1min；

⑤ 最大速度（13, 000 rpm）离心2min；

⑥ 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5min；

⑦ 4℃最大速度（13, 000 rpm）离心10~15min；

⑧ 弃上清，尽量除去管壁上的液体；

⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13, 000 rpm）离心5min；

⑩ 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。

4、连接。体系如下：

DNA 2μl

10×buffer 10μl

T4 ligase 1μl

ddH2O 87μl

100μl

12-14℃ overnight

连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48h）。连接完成后，65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中。

然后就可以用回收的链接片段做PCR了

（本文转载丁香通）

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