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实验小窍门

点击次数：  更新时间：2017/8/14 9:53:16  

对于经历了硕士、博士以及博士后磨练的前辈们，大家肯定都有自己的科研体会和实验技巧的窍门或者"绝活"！而这些窍门有的可能是书本上都学不到的。对于新入实验室的师弟师妹们来说，听听师兄师姐们的实验心得可以使自己更快进入科研角色，也避免走很多的弯路。

　　

经验（一）

　　

形态学方法

　　

免疫组织化学

　　

实验对象：冰冻切片

　　

步骤：

　　

1.  室温下复温30  Min.  0.  01 M PBS清洗5  Min×3；

　　

2.  加入配好的0.  3% Triton X100（30% Triton X100＋0.  01 MPBS 100  Ml）30  Min.  以增加细胞的通透性.  0.  01 MPBS清洗5  Min×3；

　　

3.  5%小牛血清封闭1 h0.  01 MPBS清洗5  Min×3； 加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1.  00 g＋0.  01 MPBS 100  Ml)稀释的一抗.  4 ℃存放24-48 h；吸去抗体.  0.  01 MPBS洗5  Min×3；

　　

4.  加入配好的0.  3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80  Ml＋0.  01 MKPBS 100  Ml＋30%过氧化氢）30  Min.  以消除内源性过氧化物酶的影响.  0.  01 MPBS清洗5  Min×3；

　　

5.  加入0.  01 MPBS稀释的的二抗.  室温孵育2 h。0.  01 MKPBS洗5  Min×3；

　　

6.  加入ABC复合物之类的抗体.  室温孵育2 h.  0.  01 MPBS洗5  Min×3；蒸馏水迅速冲三次；

　　

7.  加入显色液.  进行免疫组织化学显色.  时间一般不超过30  Min.  可不时在显微镜下进行观察.  待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液.  用蒸馏水迅速冲三次后加入0.  01 MKPBS终止反应；

　　

8.  梯度酒精脱水之后.  封片.  拍照。

　　

细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面.  能避免双氧水对目的蛋白的影响

　　

经验（二）

　　

（1）实验技术大类：

　　

免疫测定与诊断技术

　　

（2）具体实验技术名称：

　　

ELISA

　　

（3）实验对象：

　　

肿瘤病人血清标本

　　

（4）简要步骤:

① 包被：用包被缓冲液将 MBP/OY-TES-1稀释至1.  0μ g/  Ml.  取100μl/孔包被酶标板.  4 ℃湿盒过夜。1×PBS-T洗板3次（室温静止30sec/次）.  甩去液体.  用纸吸干；

　　

② 封闭：5%脱脂奶（200μl/孔）37 ℃封闭30  Min.  1×PBS-T洗板4次.  甩去液体.  用纸吸干；

　　

③ 上血清：加入待检稀释血清（1:400）.  阳性对照和空白对照各100μl/孔.  37 ℃湿盒孵育1 h.  1×PBS-T洗板4次.  甩去液体.  用纸吸干；

　　

④ 上二抗：加入Biotin-绵羊抗人I g g单克隆抗体（1:1000）.  37 ℃湿盒温育1 h.  1×PBS-T洗板4次.  甩去液体.  用纸吸干；

　　

⑤ 上标记物：加入Avidin- hRP（1:1000）.  37 ℃湿盒温育30  Min.  1×PBS-T洗板4次.  甩去液体.  用纸吸干；

　　

⑥ 显色：T MB避光显色15  Min.  加1N  h2SO4终止反应；

　　

⑦ 酶标仪OD450与OD630双波长读数。

　　

（5）我的窍门或者心得体会：

1.  我没用试剂盒做（尚未有商业化试剂盒开发）.  所以一切数据都要自己计算.  包括包被蛋白浓度.  一抗浓度.  二抗浓度.  计算时务必不能出错.  要不就会功亏一篑。

　　

2.  用任何试剂前都要把试剂混匀.  因为蛋白是很容易沉淀的。

　　

3.  用固定的几把移液器.  这样可以尽可能的较少误差。

　　

4.  湿盒孵育前要先把湿盒放在37°进行温度平衡.  这样可以减少达到平衡的时间.  而且也可以避免符合试验温度的孵育时间不够。

　　

5.  等板底的水珠挥发以后再读数.  要不会出现负值。

　　

6.  实验时尽量少开口说话（因为大部分做的是蛋白的测定.  口水避免不了会使所测蛋白降解的啊.  呵呵）

　　

经验（三）

　　

（1）实验技术大类：

　　

动物建模

　　

（2）具体实验技术名称：

　　

早产儿视网膜病变动物模型建立

　　

（3）实验对象：

　　

C57BL/6J小鼠

　　

（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内.  氧气的流量控制在0.  5～1.  0 L/  Min.  使容器内氧气分压控制在75%±2%.  期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料.  加食.  换水.  替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d.  5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。

　　

（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响.  左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性.  避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型.  效果良好。虽然有资料表明.  将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内.  然后返回正常空气环境.  同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型.  但在预实验中我们发现.  随着氧浓度的升高.  视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加.  但母鼠的死亡率却明显增加。另外在预实验中.  为了简化实验流程.  同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象.  我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养.  但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度.  每2 d对调母鼠同时更换水.  垫料.  食物.  这样基本可避免母鼠死亡.  同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。

　　

经验（四）

　　

（1）实验技术大类：

　　

动物建模

　　

（2）具体实验技术名称：

　　

早产儿视网膜病变动物模型建立

　　

（3）实验对象：

　　

C57BL/6J小鼠

　　

（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内.  氧气的流量控制在0.  5～1.  0 L/  Min.  使容器内氧气分压控制在75%±2%.  期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料.  加食.  换水.  替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d.  5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。

　　

（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响.  左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性.  避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型.  效果良好。虽然有资料表明.  将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内.  然后返回正常空气环境.  同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型.  但在预实验中我们发现.  随着氧浓度的升高.  视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加.  但母鼠的死亡率却明显增加。另外在预实验中.  为了简化实验流程.  同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象.  我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养.  但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度.  每2 d对调母鼠同时更换水.  垫料.  食物.  这样基本可避免母鼠死亡.  同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。

（本文转载丁香通）