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基因组DNA的快纯化

点击次数：  更新时间：2017/8/12 19:23:49  

试剂、试剂盒 尾部缓冲液 蛋白酶 K

　　

仪器、耗材 离心管 玻璃棒

　　

实验步骤 第 1 天

　　

1. 大约 1.5 cm 长的尾部活检样品放在一个 1.5 ml 盛有 0.7 ml 尾部缓冲液的小离心管中，加 35 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K，在 55℃ 振摇温育过夜。

　　

尾部缓冲液（配 25 ml）

　　

50 mmol/L Tris，pH 8                           1.25 ml 1 mol/L Tris，pH 8

　　

100 mmol/L EDTA，pH8                        5 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8

　　

100 mmol/L NaCI                                  0.5 ml 5 mol/L NaCI

　　

1% SDS                                              1.25 ml 20% SDS

　　

存放于室温。

　　

蛋白酶 K：10 mg/ml 水溶液，贮存于 -20℃。

　　

第 2 天

　　

2. 加 7 μl 10 mg/ml RNA 酶（不含 DNA 酶），在 37℃ 孵育 1~2 小时。

　　

3. 在微量离心机中对样品离心 20 分钟以沉淀鼠毛。

　

4. 小心转移 0.5 ml 上清，注意不要搅动沉淀。

　　

5. 在管子中加 0.5 ml 异丙醇并通过翻转轻轻地进行混合。应该立即有线状沉淀形成。

　　

不要剧烈混合。不要使 DNA 形成紧密团块，否则会难以绕缠。

　　

6. 在 Bunsen 灯的火焰上加热封闭 100 μl 玻璃小吸管的末端。

　　

7. 把末端封闭的小吸管浸到 DNA 溶液中并剧烈搅拌来缠绕 DNA。一直搅动吸管直到 DNA 紧紧地缠绕到上面。

　　

8. 洗 DNA 是在三个顺序排列的盛大约 50 ml 乙醇的烧杯中各浸 10 次（1 个是 70% 乙醇，另 2 个是 100% 乙醇）。洗 5~8 个样品后换洗涤溶液。

　　

9. 用一片胶带标记玻棒末端，把它插在（DNA 端朝上）一块橡皮泥，使风干 10~15 分钟。

　　

10. 用钻石记号笔在黏附了 DNA 的那一末端刻线，弄断玻棒，把带 DNA 的那段放到已作标记的微量离心管中。

　　

11. 加 0.5 ml TE ( pH 8 )。样品在室温下振荡过夜。

　　

第 3 天

　　

12. 稍稍振荡管子，用干净镊子拿掉玻璃棒（在不同样品的操作之间烧一下镊子）： 继续振摇 1~2 小时。（如果样品只是用来进行 PCR 分析，玻棒可以留在管子里）。

　　

13. 以 1:10 稀释样品，测 OD260 值以确定浓度（1 OD260=50 μg/ml).

　　

14. DNA 贮存在 4℃。