实验服务

病理学 您的位置:首页 > 实验服务 病理学

细胞增殖检测:3H同位素渗入法实例

点击次数:  更新时间:2017/4/10 14:13:14  

一、原理

 

淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下,产生增殖反应,DNA和RNA合成明显增加,如在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

 

二、仪器和材料

 

RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、3H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑(PPO)0.5g、1,4-双-(5-苯基恶唑基)-苯

 

(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混匀] 200目筛网,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。

 

三、实验步骤

 

1、脾细胞悬液制备

 

无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗3次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用台酚兰染色

 

计数活细胞数(应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。

 

2、淋巴细胞增殖反应

 

将脾细胞悬液加入到96孔培养板中,200μL/孔,每一份脾细胞悬液分装6个孔,3孔加ConA(5ug/mL),另3个孔不加ConA 作为对照。置5% CO2,37℃培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR 20μL,使其终浓度为

 

(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7mL闪烁液,用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

 

3、数据处理及结果判定

 

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对

 

非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

 

以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度,用刺激指数(SI)来表示

 

                              实验孔cpm

                   SI=  ─────────

                              对照孔cpm

 

受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值,即可判定该项实验结果阳性。