DNA实验技术 您的位置：首页 > 实验方法 DNA实验技术

利用CTAB法提取植物基因组DNA

点击次数：  更新时间：2017/2/27 10:08:22  

　　一、实验原理

　　CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高离子强度（0.7mol/L）的溶液里是可溶的，通过离心可将复合物同蛋白质、多糖类物质分开。在酚仿变性的条件下，去除残留的CTAB和蛋白质等杂质，然后利用异戊醇或无水乙醇将DNA分子从上清溶液中沉淀出来，最后用TE溶解DNA，并加入RNA酶以去除基因组中的RNA，置于-20℃备用。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体中提取核酸，例如：植物的叶片组织。

　　二、实验材料及试剂

　　实验材料：新鲜植物叶片。

　　试剂与溶液：

　　CTAB提取缓冲液，Tris-饱和酚，氯仿-异戊醇（24:1），异丙醇，70%乙醇，含RNase 的TE溶液。

　　CTAB提取缓冲液：2%（M/V） CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-Cl（pH8.0），20mM

　　EDTA，pH 8.0，2%（V/V）β-巯基乙醇（使用前加入）。

　　三、实验步骤

　　取0.5 g 新鲜植物叶片置于研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成均匀粉末。

　　将粉末移入1.5mL离心管，加入800μL CTAB分离缓冲液，上下颠倒离心管，混合均匀。

　　将盛有样品的离心管置于65℃水浴中保温30min，其间每隔3-4min 轻摇混匀。低温12000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。

　　加入等体积的Tris-酚和氯仿异戊醇，上下颠倒离心管，混合均匀；低温12000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。

　　加入等体积的氯仿异戊醇上下颠倒离心管，混合均匀；低温12000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。

　　加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃沉淀30min。

　　低温12000rpm离心5min去上清，加入500μL 70%乙醇洗涤沉淀，常温12000rpm 2min，去上清，沉淀尽量干燥。

　　加入适量含有RNase的TE（20μL）溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。

　　取适量基因组DNA样品，电泳检测。

　　四、注意事项

　　Tris-酚，氯仿和β-巯基乙醇均为有毒试剂，使用时小心，切勿接触皮肤。

　　实验材料要新鲜。

　　液氮研磨要充分，研磨过程中可补充液氮继续研磨。

　　酚氯仿抽提时离心时间可长些，取上清时不要触及蛋白层。