实验方法

蛋白质表达分析 您的位置:首页 > 实验方法 蛋白质表达分析

一位“蛋白质纯化技术”的自白书···

点击次数:  更新时间:2017/11/14 14:26:12  

纯化是注定辛苦的旅行

路上少不了筛选和优化

但那又怎样

哪怕运行千遍

也要纯得漂亮

我是中洪博元蛋白组,我为自己代言!


以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。


一. 实验试剂及材料


实验材料:大肠杆菌BL21


试剂、试剂盒:LB液体培养基、 氨苄青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸馏水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化钠


仪器、耗材:摇床 、离心机、 层析柱、 离心管、 移液枪、 枪头盒 、烧杯 、玻璃棒



(实拍图,请勿盗用)

二. 获得目的基因


1.  通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

 

2.  通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。


三. 构建重组表达载体


1.  载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

 

2.  PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

 

四. 获得含重组表达质粒的表达菌种


1.  将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

 

2.  测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

 

3.  以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。


五. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导


1.   接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中(含100 ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。

 

2.  按1∶50或1:100的比例稀释过夜菌,一般转接1 mL过夜培养物于100 mL(含100 ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8(最好0.6,大约需3 h)。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.   对照组不加诱导剂,实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l,37℃继续培养1-3h。
 

4.  12 000 rpm 离心10 min,弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
 

六. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化 


1.  NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mL NTA介质,并分别用8 mL 去离子水,8 mL上样缓冲液洗涤。

 

2.  重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5 mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60 min,4℃ 12000 rpm 离心 30 min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.  上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
 

4.  洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液,约3-4 h,取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。
 

5.  洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。


七. 注意事项


1.  选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。

 

2.  融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。


3.  菌液OD值要小于1,否则细胞太浓太老,不易破碎,且质粒易丢失。


4.  诱导时间最好做一个梯度,不同蛋白诱导时间需摸索。


5.  诱导温度适当摸索:25、30℃。


6.  IPTG浓度:一般在1 mM 以内,可适当摸索。


7.  超声条件可视实际情况改变,只要使菌体裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠。