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探针的选择与标记，这些套路你知多少

点击次数：  更新时间：2017/10/27 13:56:33  

一. 探针选择要求

①适当的探针长度；②能对探针进行高效率的标记；③能长期保持稳定。核酸探针多种多样，基本上可分为DNA、RNA和人工合成寡核苷酸三大类。

二. 不同探针的对比

三. 探针标记

各种不同类型的探针需要经过恰当的标记，才能在原位杂交中应用。

1、切口平移法(nick translation)

（1）按下列配比混合：未标记的dNTP 10μl、10×切口平移缓冲液5μl、待标记的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至终体积 50μl；

（2）置于 15℃ 水浴60min；

（3）加入5μl EDTA终止反应；

（4）反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L，加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。 　

2、随机引物合成法

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400～600个，可以获得大量的有效探针。

 其步骤

（1）200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于Eppendorf管内，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。

（2）与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管内混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未标记的dNTP溶液 1μl、10×随机标记缓冲液 1μl、[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。

（3）将步骤(1) Eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。

（4）加入5U(约1μl) Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12 000g 离心1～2s，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3～16h。

（5）在反应液中加入10μl缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在 -20℃ 下备用。同时计算放射比活性。 　　

3、末端标记法

通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)催化标记的dNTP加到单链或双链DNA的3，末端上。