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一起玩转miRNA靶基因验证

点击次数：  更新时间：2017/10/12 13:46:28  

一. 检测原理

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面， 通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

二. 实验材料

仪器设备：荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、低速离心机、 血球计数板 、水浴锅、酶标仪；

统计学处理  GraphPad Prism作图

三. 实验步骤

主要分为：质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。

质粒转染细胞：  

1、细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。

2、转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。

1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly：Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl；

2) 配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试 剂每孔0.25μL； 

3) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min；

4) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min；

5) 每孔弃去50ul培养基，将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中；

  

6) 转染6小时后，换新鲜完全培养基 ；

 双报告基因检测  

1、质粒共转染48小时后，弃去培养基，用100μl 1XPBS洗1遍；

2、 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS；

3、去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温；

4、每孔加50μl稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂 解；

5、白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl， 加入100 μl预先混好的LAR II，2s后测数据；

   

6、每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数 据  注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。