蛋白质表达分析 您的位置：首页 > 实验方法 蛋白质表达分析

SDS-PAGE凝胶电泳那些事儿

点击次数：  更新时间：2017/10/11 15:35:54  

一. SDS-PAGE的原理

SDS-Page电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。

二. SDS-PAGE的种类

1、连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

2、不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

三. SDS-PAGE实验操作

1、试剂配制（注意：所用试剂均需分析纯）

1）5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，Tris-HCl，pH: 8.8：称取181.71g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加超纯水定容至1000ml。

2）29.2%丙烯酰胺-0.8% N,N’-甲叉双丙烯酰胺：称取29.2g丙烯酰胺，0.8g N, N’-甲叉双丙烯酰胺，加超纯水溶解，并定容至100ml，混匀后用滤纸过滤，避光保存。

注意：丙烯酰胺为剧毒试剂，易被皮肤吸收，使用过程中勿必要戴橡胶手套。

3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：称取1g十二烷基硫酸钠，加超纯水溶解，并定容至10ml，室温保存。

4）四甲基乙二胺原液（TEMED）

5）10%过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加10ml超纯水溶解。

6）1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH: 6.8：称取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris-Base）加适量纯化水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加超纯水定容至100ml。

7）10倍电极缓冲液贮液：称取甘氨酸288.26g，三羟甲基氨基甲烷60.57g，十二烷基硫酸钠20g，加超纯水定容至2L。

8）非还原型2×样品缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g，溴酚蓝0.02g，十二烷基硫酸钠8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解并定容至200ml，混匀，分装小管，2~8℃储存。

9） 还原型2×样品缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g，溴酚蓝0.02g，十二烷基硫酸钠8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解并定容至200ml，再加入β-巯基乙醇40ml，混匀，分装小管，2~8℃储存。

10）考马斯亮蓝染色液：450ml乙醇，450ml纯化水，混匀，加入称好的2.5g考马斯亮蓝R-250及100ml冰醋酸，放磁力搅拌器上搅拌至少8小时，过滤即得。

11）考马斯亮蓝脱色液：450ml乙醇，450纯化水，混匀，再加100ml冰醋酸，混匀即得。

12）分子量标准蛋白：冻干粉产品按说明书溶解稀释后，经100℃水浴，放冷后分装于小管中，-20℃保存；液体产品则直接分装于小管中，-20℃保存，标签上注明使用前需水浴，有效期6个月。

2、样品处理

取一定量待检样品按蛋白含量用超纯水稀释至1mg/ml，取稀释好的样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。分子量标准蛋白的处理方法按标签说明，如需水浴则同样品一起100℃加热5-10min，取上清点样，如不需水浴则直接上样。

（制胶实拍图）

3、凝胶配置

制备分离胶：将配好的分离胶灌入电泳槽中，加水覆盖，室温下聚合。（室温不同，聚合时间不同）

凝胶配方如下（两块胶）：

凝胶种类	分离胶				浓缩胶
凝胶浓度	8%	10%	12%	15%	5%
超纯水	6.89ml	5.89ml	4.89ml	3.39ml	3.44ml
30% Acrylamide/Bis Solution	4.0ml	5.0ml	6.0ml	7.5ml	0.83ml
1.0M Tris (pH 6.8)	---	---	---	---	0.63ml
1.5M Tris (pH 8.8)	3.8ml	3.8ml	3.8ml	3.8ml	---
10% SDS	150μl	150μl	150μl	150μl	50μl
10% APS	150μl	150μl	150μl	150μl	50μl
TEMED	9.0μl	9.0μl	9.0μl	9.0μl	5.0μl

制备浓缩胶

待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。

4、SDS-PAGE电泳

调胶：拔掉SDS胶上的梳子，并用小针调整齿的位置（使它们都平行）。

点样：用20μL的小枪头，吸煮过的样品10μL，对准胶孔点样，注意不要把样品点在外面。使用适当的分子量蛋白marker。

电泳：电泳仪正负极接好，打开电源。浓缩胶：电压 low 100V

分离胶：电压 high 150V。

卸胶：等胶内的所有的蓝色都跑出去，电泳停止，一般时间为1-2小时左右。把胶板从电泳仪上卸下，用刀片把胶板撬开，胶的浓缩胶部分割除；

染色：放入考马斯亮蓝R-250染色液中进行常温过夜染色；

脱色：将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色，直到背景发白。

（脱色实拍图）

5、数据处理：

扫描：将干燥的凝胶放入扫描仪，扫描后计算纯度。

纯度计算：按峰面积归一法计算目标蛋白的纯度。

分子量的计算：以分子量标准蛋白的对数分子量与其迁移率作标准曲线，代入样品迁移率计算该样品的分子量。