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纯化质粒（碱裂解法）

点击次数：  更新时间：2016/3/14 10:16:33  

　　实验材料 大肠杆菌

　　试剂、试剂盒 LB 葡萄糖缓冲液 乙酸钾

　　仪器、耗材 离心管

　　实验步骤

　　1. 单个大肠杆菌克隆接种到 2 ml 含适当抗生素的 LB 中。37℃ 剧烈振荡孵育 5~8 小时。或者可以培养过夜使饱和。

　　2. 倒 1.5 ml 培养液到已作标记的微量离心管中。把剩下的培养液存放在 4℃。

　　3. 在微量离心机上离心 2 分钟以沉淀大肠杆菌。吸掉培养液。

　　4. 用 100 μl 葡萄糖缓冲液重悬沉淀物。在室温孵育 5 分钟。在这时候充分悬浮大肠杆菌对于获得尽可能大的产量是很重要的。

　　葡萄糖缓冲液（配 500 ml）

　　50 mmol/L 葡萄糖                    4.5 g 葡萄糖

　　10 mmol/L EDTA，pH 8.0       10 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0

　　25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0   12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

　　过滤除菌，贮存在 4℃。

　　5. 在管中加 200 μl NaOH-SDS 溶液，轻轻地颠倒混合。冰浴 5 分钟。溶液应该明显变清了，但仍然非常黏。

　　NaOH-SDS 溶液（配 50 ml）

　　0.2 mol/L NaOH               0.4 g NaOH

　　1% SDS                           2.5 ml 20%  (w/v)  SDS

　　可在室温存放 2~3 周。

　　6. 每个管中加 150 μl 冷的 3 mol/L 乙酸钾，pH 5.2，颠倒混合；冰浴 5 分钟，会形成白色絮状沉淀。

　　3 mol/L 乙酸钾：

　　5 moI/L 乙酸钾          60 ml

　　冰乙酸                      11.5 ml

　　加水到 100 ml。贮存在 4℃。

　　7. 在小离心机上离心 5 分钟，然后转移 400 μl 上清到一个已作标记的管中。

　　8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/异戊醇（50:49:1) 溶液，振摇，在离心机上离心 5 分钟。

　　酚/氯仿/异戊醇（50:49:1)

　　50% TE 饱和酚

　　49% 氯仿

　　1% 异戊醇

　　避光贮存于 4℃。

　　9. 小心地把水相（上层）转移到已作标记的管中。

　　10. 加 1.0 ml 100% 乙醇，混合，然后离心 5 分钟沉淀 DNA。

　　11. 去掉上清。应该能看到一个小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗涤沉淀物，并离心 5 分钟。

　　12. 去掉上清。管子离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体，让乙醇挥发 5~10 分钟。（或者可以真空干燥管子。）

　　13. 用 25~50 μl 的 TE（pH 8.0）重悬沉淀物。质粒 DNA 应该很容易溶解。不易溶解的物质很可能不是 DNA。

　　14. 在这 32 μI DNA 溶液中加 8.0 μl 4 mol/L NaCl 和 40 μl 113% (w/v) PEG8000。混合均匀并冰浴 1 小时或更长时间。

　　15. 用小离心机在 4℃ 离心 15 分钟以沉淀 DNA。

　　16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗涤沉淀物，离心 5 分钟。

　　17. 小心去掉乙醇，离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体并让乙醇挥发 5~10 分钟。

　　18. 根据测序方法的要求用 20~30 μl TE 或水重悬沉淀物。

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