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β-半乳糖苷酶的原位染色实验

点击次数：  更新时间：2016/12/14 15:07:16  

β-半乳糖苷酶的原位染色实验

 

试剂、试剂盒: D-PBSA 、染色液、质粒

实验步骤

一、材料：

非消毒物品

 

1. D-PBSA

 

2. 底物：X-gal（nvitrogen），以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL，用多聚丙烯管-20℃ 避光保存，最长可达 6 个月

 

3. 固定液：1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛，均以 PBSA 液配制；将 85 mL 水、10 mL 的 10×D-PBSA、5 mL 福尔马林（37% 甲醛溶液）及 0.2 mL 戊二醛（25% 溶液）混合，制备成固定液，于 4℃ 储存

 

4. 染色液：含 5 mmol/L 铁氰钾，5 mmol/L 亚铁氰钾，2 mmol/LMgCl2，以 D-PBSA 配制，4℃ 储存

 

5. 底物/染色液：1 mg/mLX-gal，以染色液配制，现用现配

 

6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液

 

7. 将β-gal 的表达质粒作为报告基因转染（如：pcMVβ-gal ）

 

二、操作步骤：

1. 用 2 mL D-PBSA 液洗涤细胞（如在 6 孔培养板上）。

 

2. 用 1 mL 固定液于室温下固定细胞 5 min。

 

3. 用 2 mL D-PBSA 洗涤细胞 2 次。

 

4. 将 1 mL 底物/染色液加入到每个培养孔内，37℃ 孵育 2 h。

 

5. 用 2 mL D-PBSA 液冲洗每孔细胞，在倒置显微镜下观察细胞，计数蓝染（β-gal 阳性）细胞。

 

6. 培养板的储存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的缓冲盐溶液，室温下固定 10 min，然后用缓冲盐溶液洗涤细胞，4℃ 储存缓冲盐溶液。