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免疫球蛋白标记技术

点击次数:  更新时间:2016/11/8 17:38:43  

免疫球蛋白标记技术

 

免疫标记技术


是用特定的物质标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。可借助各种仪器观察结果或进行自动化测定,可在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究;或应用各种液相和固相免疫分析方法,对液体中的抗原、半抗原或抗体进行定性和定量测定。


实验方法原理: 


酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。


实验材料: 抗体


试剂、试剂盒: 戊二醛液、萘氏试剂、PBS、NaIO4、碳酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液、NaBH4


仪器、耗材: 搅拌器、分光光度计、离心机、透析袋、烧杯、试管、吸管


实验步骤


一、酶制剂及其底物

 

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求

 

1.  来源方便,易于纯化;

 

2.  比活性高,性质稳定;

 

3.  酶活性和量能用简单方法测定。

 

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

  

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18 %。HRP由多个同功酶组成,分子量为40000,等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58 %以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403 nm和275 nm,一般以OD403 nm /OD275 nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。

  

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下

 

               HRP

         DH2+H2O2────→D+2H2O

  

供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3,3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。

  

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

 

二、HRP标记抗体的方法

 

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

  

1.  戊二醛二步法

 

(1)原理

 

戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

 

(2)标记步骤

 

①称取HRP25 mg溶于1.25 %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。

 

②反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1 ml/1 分钟,收集棕色流出液。如体积大于5 ml,则以PEG浓缩至5 ml。放置25 ml小烧杯中,缓慢搅拌。

 

③将待标记的抗体12.5 mg用生理盐水稀释至5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

 

④用1 M PH9.5碳酸缓冲液0.25 ml,继续搅拌3 小时。

 

⑤加0.2 M赖氨酸0.25 ml,混匀后,置室温2 小时。

 

⑥在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4 ℃1 小时。

 

⑦3000 rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。

 

⑧将上述溶液装入透析袋中,对0.15 M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10000 rpm离心30 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

 

(3)结果判定

 

①定性及效价滴定

 

用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。

 

②定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1 cm)。

 

酶量(mg/ml)=OD403 nm×0.4

 

IgG量(mg/ml)=OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62

 

        酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量

克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4

       40000    160000   IgG量

 

③本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4 %的酶与蛋白质结合。

 

2.  简易过碘酸钠法

  

本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70 %的HRP和Ig结合,99 %的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

 

(1)原理

 

经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

  

(2)标记步骤

 

①称取5 mgHRP溶解于1 ml蒸馏水中。

  

②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20 分钟。

  

③将上述溶液装入透析袋中,对1 mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4 ℃过夜。

  

④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10 mg IgG(抗体,或SPA5 mg)在1 ml 0.01 M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2 小时。

  

⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液,混匀,再置4 ℃ 2 小时。

  

⑥将上述液装入透析袋中,对0.15 M PH7.4 PBS透析,4 ℃过夜。

 

其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的⑥、⑦、⑧。

  

(3)结果判定

 

除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。

 

IgG量(mg/ml)=(OD280 nm-OD403 nm×0.3)×0.62

  

注意事项

1.  在具备高质量HRP的条件下,所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。

 

2.  所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂,最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。

 

3.  室温搅拌时须避光,室内温度一般在25 ℃为宜。标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。

 

4.  浓的标记物相当稳定,常加入30~40 %甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1~2 年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的使用液应在12 小时内用完。切忌反复冻融。

其他

一、工作浓度的选择

  

在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

 

1.  酶标记抗体的滴定方法

 

将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。

  

2.  步骤

 

先将抗原(或抗体)用0.05 M PH9.6包被缓冲液稀释为10 μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml,4 ℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1 %BSA-PBS液依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600......(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1 ml,37 ℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液,每孔0.1 ml,37 ℃10~30 分钟。以2 M H2SO4 0.05 ml终止反应。

 

3.  结果判定

 

主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。

 

4.  有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。

 

5.  要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到最适的实验条件。