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慢病毒包装操作步骤

点击次数：  更新时间：2016/10/7 11:56:48  

　　★ 慢病毒包装操作步骤：

　　1. 在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25%胰蛋白酶消化293T细胞，以含10%血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8×106cells到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80%～90%时即可用于转染。 2. 第二天，在转染前2～4h，用5ml不含P/S的完全培养基换液（DMEM+10% FBS）。 3．按照以下实验步骤来进行转染： A、加入500ul HET Buffer A到一支洁净的1.5ml EP管中（可标记为A管） B、在另一支洁净的1.5ml EP管中（可标记为B管），加入以下试剂，终体系为500ul

　　试剂名称

　　试剂数量

　　Vector

　　10ul(1.0ug/ul)

　　Lentiviral packaging mixture

　　15ul(1.0ug/ul)

　　HET Buffer B

　　50ul

　　ddH2O

　　425ul

　　C、将B管中的DNA温合液缓缓逐滴加入到A管中，用移液器轻轻混匀10min。

　　D、将混匀后的混合物室温静置30min，然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃，5% CO2培养箱中培养。 4. 第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液（DMEM+10% FBS+P/S）。 5. 第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基（DMEM+10% FBS+P/S）至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。 6. 第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以 0.45 μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。 7. 4℃，50000g 高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记 。 8. 小心弃去上清，晾干，按200ul /10cm培养皿的量加入DMEM（不含血清、双抗）或者PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀（避免产生气泡），继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80 ℃ 冰箱保存。

　　★ 慢病毒生物学滴度测定操作步骤：

　　1. 在滴度测定的前一天取一块48孔板，按照每孔3×104cells的密度接种HEK 293细胞。 2. 加polybrene到新鲜的完全培养基中（DMEM+10% FBS+P/S），使其终浓度为8ug/ml。 3. 用含有polybrene的完全培养基10倍梯度稀释病毒，具体做法如下：取一个96孔板，每孔含有90ul培养基，第一个孔加入10ul待测病毒原液，混匀后吸取10ul病毒混合液至第二个孔（混匀时尽量不要产生气泡），如此稀释至第六个孔（即稀释105倍）。

　　Titer

　　1ul

　　0.1 ul

　　0.01 ul

　　0.001 ul

　　0.0001 ul

　　Virus Stock

　　5 or 10

　　10

　　10

　　10

　　10

　　Medium with 8ug/ml polybrene

　　45 or 90

　　90

　　90

　　90

　　90

　　Load volume

　　10

　　10

　　10

　　10

　　10

　　4. 各吸取10ul病毒稀释液到相对应的48孔板中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养过夜，16h～24h后用新鲜的完全培养基换液（DMEM+10% FBS+P/S）。 5. 置于37℃，5% CO2 培养箱培养48h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量(如果观察不清晰可以先用PBS（pH7.4）换液后再进行观察）。一般情况下，在最高稀梯度10m的孔数出现N（N<10）个带荧光的细胞，则病毒滴度为nx10mtu n="">10，则需要继续稀释。

　　★ 使用注意事项：

　　1. 需要使用去内毒素的质粒抽提试剂盒来抽提质粒，而且质粒OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。

　　2. 细胞生长状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞生长状态和较少的细胞传代次数，细胞代数不要超过20代。

　　3. 在质粒转染时细胞培养基里面不要添加抗生素（如P/S、G418等）。

　　4. 病毒包装试剂盒应与HET高效转染试剂盒配套使用才能达到最佳的病毒包装效率；一般来说包装基因过表达的慢病毒其生物学滴度能够达到107～108TU/ml，而包装RNAi的慢病毒其生物学滴度能够达到108～109TU/ml。

　　5. 病毒切勿反复冻融，冻融次数尽量不要超过3次，每冻融一次大约有10%左右的病毒损失，应按每次使用的病毒量来分装然后冻存于-80度冻箱，保存时间尽量不要超过6个月。