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慢病毒RNAi干扰

点击次数：  更新时间：2015/12/22 14:14:55  

　　（一）原理

　　慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

　　（二）服务流程

　　（1) 含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取；

　　（2) 慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞；

　　（3) 培养48~72h，收集培养上清；

　　(4) 病毒的纯化和浓缩（超离和/或超滤）；

　　(5) 滴度测定、目的基因检定

　　(6) 将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞，筛选混合稳定细胞株，并检测靶基因的表达。

　　客户提供

　　（1)表达miRNA/shRNA的质粒（提供测序图谱）或所要Knockdown的靶基因的名称、序列；

　　（2)所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化

　　（3)若需要检测靶基因的表达变化，如需要请提供相应的抗体

　　我们提供

　　（1)提供重组后的慢病毒载体质粒

　　（2)提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液